受體細胞去核
作為細胞核移植的受體細胞主要有三類:去核的卵母細胞、受精卵和2-細胞胚胎,其中卵母細胞應用最為廣泛。有人用兩個去核卵母細胞融合后產(chǎn)生的胞質(zhì)作為受體進行各代核移植,以增核移植胚胎的細胞數(shù)和提高繼代移植效率。研究證明,體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞核移植成功率不如體內(nèi)成熟的卵母細胞,其原因可能是卵母細胞在體外成熟過程中,需要合成一些蛋白質(zhì)來完成第一次減數(shù)分裂,體外成熟的一些卵母細胞其活動有可能受到抑制。 2.1卵母細胞的去核方法
2.1.1盲吸法用微細玻璃管在第一極體下盲吸,吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周圍的部分細胞質(zhì),但該方法成功率低。為提高去核率,利用Hoechst33342染料對染色質(zhì)的特異性染色作用,在熒光顯微鏡下去核后判斷去核是否完成,去核準確率大為提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml)染色,在紫外線下照射的時間控制在10s以內(nèi),未觀察到對胚胎發(fā)育的負面影響。 2.1.2半卵法用微細玻管針在透明帶上做一切口后,用微細玻管吸去一半染色質(zhì)至另一半空透明帶內(nèi),即將卵母細胞分為兩半,然后用Hoechst33342染色,確定不含染色體的一半為細胞質(zhì)受體。其操作方法如下,將卵母細胞移入35mm含有mPBSA(磷酸緩沖液,其中有D-葡萄糖1000mg/l、丙酮酸36mg/l、0.4%牛血清白蛋白、1%青霉素和鏈霉素10000μg/ml)的皮氏培養(yǎng)皿中進行顯微操作,首先分兩步進行分割透明帶,即先在透明帶上切一小口,然后用另一切割針擴大切口,從而分割透明帶。透明帶被切除后轉(zhuǎn)移到含有mPBSA+5μg/ml細胞松弛素B的35mm的皮氏培養(yǎng)皿中作用3一5min,然后用固定針(內(nèi)徑為透明帶的l/5一1/3,外徑接近透明帶的直徑)固定,分割針進入透明帶的隙口中并將該針固定在靠著透明帶的地方,緩慢吸取卵母細胞液,當分割針中吸取了一半卵母細胞液時,這時將該針從卵黃隙中移出,并靠著透明帶切割邊緣輕微地擦過以達到完全的分割,將其針中的卵母細胞液移入準備好了的空透明帶中,并用Hoechst33342染色,熒光顯微鏡下觀察不發(fā)熒光的作為受體卵母細胞。 2.1.3離心去核Tatham等以15000g、2min離心牛卵母細胞,用鏈霉蛋白酶去除卵母細胞透明帶(ZP),經(jīng)滲透壓梯度離心,MⅡ期紡錘體可從大多數(shù)卵母細胞中分開,把無透明帶的去核胞質(zhì)作核移植的供質(zhì),同分裂球聚集經(jīng)電融合成核移植胚,最后放入藻酸鈉假透明帶中,能在體外卵裂和發(fā)育,但其效果還有待于進一步研究。 核移植
2.1.4 末Ⅱ期去核法Bordignon等提出把卵母細胞先激活使之處于末Ⅱ期,在排出第二極體時吸出第二極體及周圍的少量細胞質(zhì),從而達到去核。這種方法避免使用DNA染料和經(jīng)紫外線照射來定位染色體,并且去除的細胞質(zhì)相對較少。該去核方法比MⅡ期去核的成功率有顯著提高,但這種細胞質(zhì)容易老化,是否能對基因組完全重排序,順利完成后期發(fā)育,有待于研究。2.2 去核時間與去核成功率多數(shù)研究者在多數(shù)卵母細胞出現(xiàn)第一極體的成熟時期去核,去核時間,體內(nèi)成熟在發(fā)情開始后48h,體外成熟22-24h。卵母細胞去核程序與重構胚中再程序化狀況密切相關,去核率越高,其克隆胚最終發(fā)育成正常胚的可能性越大。去核率的高低與卵母細胞所處的成熟時期以及所采用的方法密切相關。以前的核移植研究均采用未激活的卵母細胞作為核受體,并認為激活后卵母細胞的重排能力會下降,影響核移植的效率。但Ushijima,等和Terlovw等;研究表明,激活后的卵母細胞作為核供體時,重構胚融合和發(fā)育能力均優(yōu)于融合激活同時進行的效果。 2.3 胞質(zhì)容士與重構胚的發(fā)育潛力
有人對核反比例與重構胚發(fā)育的關系進行研究,結果表明,卵母細胞去除的胞質(zhì)量與預期供核體積大小相當時,可以為細胞周期的相互作用創(chuàng)造最好的條件,而去除太少或太多并不理想?;谌コ毎|(zhì)的量與去核率關系切,因此,在保證有較高的去核情況下。去除的胞質(zhì)應盡量少。