雜交瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）

介紹

雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過(guò)融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無(wú)限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞，這種雜種細(xì)胞叫做雜交瘤細(xì)胞。

制作方法

1）瘤細(xì)胞培養(yǎng)（無(wú)特殊要求）

骨髓瘤細(xì)胞呈懸浮或輕微附著形式生長(zhǎng)，如附著性生長(zhǎng)的細(xì)胞多時(shí)，用吸管輕輕吹打或輕輕叩擊培養(yǎng)容器即可分離下來(lái)。通常要維持細(xì)胞于指數(shù)生長(zhǎng)期（細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為15~20小時(shí)），56每3~5天取細(xì)胞0.2~1ml移入到10ml新培養(yǎng)液中，其最大細(xì)胞密度不能超過(guò)5×10~10/ml。一般使用含有高糖的DMEM培養(yǎng)液，并補(bǔ)加有pH的穩(wěn)定劑HEPES。

2）免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備

免疫小鼠：取6~8周齡Balb/C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，3~5天后用于融合。

脾細(xì)胞制備：1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。

2．無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次。

3．把脾臟置于已消毒的90~100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中。

4．在脾中部切開(kāi)一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無(wú)血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可。

5．把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，加10~20ml培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘。

6．離心（800~1000轉(zhuǎn)/分）計(jì)數(shù)，備用。

3）飼細(xì)胞的制備：常用小鼠胸腺細(xì)胞或小鼠的腹腔細(xì)胞

飼細(xì)胞的制備：

小鼠腹腔細(xì)胞制備方法：

1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。

2．切開(kāi)腹部皮膚剝向兩側(cè)，暴露出腹壁。

3．用無(wú)菌7號(hào)針頭注射器，吸取3ml無(wú)血清培養(yǎng)液。

4．用小鑷夾起腹壁，注入3ml無(wú)血清培養(yǎng)液，用手反復(fù)輕輕揉腹壁，再反復(fù)抽吸3~5次。

5．收集末次吸得的細(xì)胞，注入50ml的離心管中，再加20ml無(wú)血清培養(yǎng)液，用吸管漂洗一次。

6．離心，去上清，用含血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×105/ml，接種入培養(yǎng)板中，24孔板每孔加0.1ml。

4）細(xì)胞融合

HAT培養(yǎng)基的制備[貯備液成分]100×次黃嘌呤（Hypoxanthine:H）胸腺嘧啶核苷（Thymidine:T）氨基喋呤（Amiropterin:A）[HT貯備液制備貯備液制備]

1．稱取136.1mgH，38.8mgT。

2．依次溶解在100ml雙蒸水中，H難溶，可加溫50~80℃促溶。

3．用0.22微米濾膜濾過(guò)除菌，每瓶分裝2~5ml，-20℃冰箱貯存。

[A貯備液制備貯備液制備]

1．稱取17.6mgA到90ml雙蒸水中。

2．滴加1MNaOH溶液并不斷搖動(dòng)，直至完全溶解，再滴加等量1MHCl溶液，恢復(fù)pH在7.0左右。3．補(bǔ)足雙蒸水至最終體積100ml。

4．0.22微米濾膜濾過(guò)除菌，分裝，-20℃冰箱貯存。使用時(shí)，每100ml培養(yǎng)液（含血清）加1mlHT貯備液和1mlA貯備液。1.0×10-2M1.6×10-3M4.0×10-5MPEG（誘導(dǎo)劑）的制備（30%~50%）

1．取分子量1000的PEG高壓蒸氣滅菌（6.8公斤，15分鐘）

2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中溫浴。

3．取無(wú)血清培養(yǎng)液37℃水浴中溫?。▎为?dú)）

4．配40%濃度時(shí)，用刻度吸管吸0.4mlPEG和0.6ml無(wú)血清培養(yǎng)液混合、37℃水中溫育備用。

細(xì)胞準(zhǔn)備

1．收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次（37℃），計(jì)數(shù)活力細(xì)胞（不少于90%）。

2．收集小鼠脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次（37℃），并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞。

3．按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。

融合方法一：

1．將1ml40%的PEG液一滴滴加入到細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管。

2．在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無(wú)血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完。

3．于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無(wú)血清培養(yǎng)基。此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感。

4．離心（800轉(zhuǎn)/分，8分鐘），去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻。

5．取96孔板，每孔加50微升。

6．取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50微升。

7．送入5%CO2溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)液。

方法二：

1．加0.2ml43%的PEG于離心管中。

2．用預(yù)先消毒的細(xì)玻璃針伸入管中輕輕攪動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。

3．室溫中置2分鐘。

4．加入10ml完全培養(yǎng)液。

5．800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。

6．2倍HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，24孔板，用取每孔中加0.5ml，96孔板每孔中加0.1ml。另7．5%CO2溫箱，37℃，一周后第一次更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中預(yù)先接種有飼養(yǎng)細(xì)胞，加2×HAT選擇培養(yǎng)液與原等量培養(yǎng)液混合后，即成為1×的HAT培養(yǎng)基。

融合后細(xì)胞培養(yǎng)

1．融合后7~10天用HAT培養(yǎng)液變量換液，以后每隔2~3天半量換液一次。

2．兩周后可改用HT培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液。

3．2~3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大，圓且透明。

4．待集落增殖生長(zhǎng)至1/3孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)。

克隆化培養(yǎng)[軟瓊脂培養(yǎng)]

1．稱1g瓊脂粉，加入到100ml雙蒸水中，高壓蒸氣滅菌，4℃冰箱保存。

2．使用前，1%的瓊脂和2×的DMEM培養(yǎng)液在45℃水浴中分別溫浴。

3．二者等體積混合后，立即加入1.5×107小鼠脾細(xì)胞，混勻。

4．立即到入平皿中，每平皿（直徑10cm）加10ml，室溫中置15分鐘。

5．另取雜交瘤細(xì)胞懸液和0.5%瓊脂等體積混合（0.25%瓊脂），加2ml到預(yù)先鋪有底層瓊脂的瓶皿內(nèi)。

6．CO2溫箱培養(yǎng)。

7．10~15天后，有細(xì)胞集落形成，適時(shí)移入24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)。如用瓊脂糖，底層濃度為0.6%，上層為0.3%瓊脂。

[有限稀釋法]

1．制備有飼養(yǎng)細(xì)胞底層的細(xì)胞培養(yǎng)板。

2．收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)陽(yáng)性培養(yǎng)細(xì)胞。

3．細(xì)胞懸液調(diào)至5~10個(gè)細(xì)胞/ml。

4．96孔板中每孔加0.1ml。

5．CO2溫箱培養(yǎng)一周后，半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

6．適時(shí)檢測(cè)每孔培養(yǎng)上清，挑選呈陽(yáng)性培養(yǎng)孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，直至確信孔中細(xì)胞為單克隆為止。

7．進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

5）抗體的檢測(cè)）常用方法：免疫熒光試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)（RIA），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。胞的篩選

ELISA法。首次檢測(cè)時(shí)間在細(xì)胞融合后10天左右進(jìn)行。

ELISA法所需試劑配置

包被緩沖液(pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):

Na2CO31.59g

NaHCO3　2.93g

加蒸餾水至1000ml

洗滌緩沖液(pH7.40.15MPBS):

KH2PO4　　0.2g

Na2HPO4·12H2O　2.9g

NaCl　　8.0g

KCl　0.2g

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸餾水至1000ml

包被抗原：pH9.6碳酸鹽緩沖液（CBS）稀釋抗原，加入到酶標(biāo)板中，100μL/孔，37℃2小時(shí)或4℃過(guò)夜。甩干，洗滌3次，3分鐘/次。

封閉（血清或脫脂奶粉）：此步有時(shí)用，有時(shí)不用。

加被檢樣品（一抗），100μL/孔，37℃半小時(shí)，甩干，洗滌3次，3分鐘/次。

加酶標(biāo)抗體（二抗），100μL/孔，37℃半小時(shí)，甩干，洗滌3次，3分鐘/次。

顯色：5ml的顯色A液,5ml的顯色B液，100μL/孔，37℃反應(yīng)10～20分鐘。

終止反應(yīng)：加2MH2SO4，50μL/孔。

結(jié)果判定。肉眼或用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

本實(shí)驗(yàn)室目前采用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌。