基因轉(zhuǎn)染技術(shù)（基因轉(zhuǎn)染技術(shù)）

簡介

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)就是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。

轉(zhuǎn)染方法

轉(zhuǎn)染指通過生化或者物理方法將目的基因?qū)胝婧思毎小?/p>感染

感染指通過病毒介導(dǎo)，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細胞。

基因運載系統(tǒng)

將某一特定的靶基因傳遞到靶細胞，需要應(yīng)用某一基因運載系統(tǒng)，這一系統(tǒng)可概括為兩大類：非病毒方法和病毒方法

非病毒方法包括以下幾種方法：

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

（1）DEAE-葡聚糖和polybrene聚陽離子法：帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。DEAE－葡聚糖僅限于瞬時轉(zhuǎn)染。

（2）磷酸鈣共沉淀法：將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀，附著于細胞膜并經(jīng)過細胞內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。

該方法的轉(zhuǎn)化效率通常很低。

（3）脂質(zhì)體染法：脂質(zhì)體能在體內(nèi)或體外提供運載外源性遺傳物質(zhì)進入細胞的載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的最大優(yōu)勢在于能在活體內(nèi)應(yīng)用。

2、生物方法

（1）直接注射法：將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細胞攝入DNA鏈進行表達，在肌細胞中，基因表達可持續(xù)數(shù)月。

（2）受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：依靠受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復(fù)合體，而這種多肽能為細胞表面的受體所識別。如若將DNA在體內(nèi)運送至肝內(nèi)，可以選將DNA和能與肝細胞受體特異結(jié)合的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過細胞內(nèi)吞過程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟所攝取。應(yīng)用該方法轉(zhuǎn)移的外源基因在活體內(nèi)的表達持續(xù)時間較短，在評估實際應(yīng)用前景上還存在一些問題。

（3）精子載體法：用精子和NDA（吡啶核甘酸輔酶）-劑孵育，可捕獲得DNA。通過受精過程，將外源性基因?qū)胧芫?，大大簡化了轉(zhuǎn)基因動物的制備過程。這項轉(zhuǎn)染方法是才發(fā)展出來應(yīng)用在魚類轉(zhuǎn)殖的最新技術(shù)，它最大有點就是簡單方便。

顯微注射法

（1）微粒子轟擊法（基因槍）?：在真空狀態(tài)下，利用粒子加速器將外面包裹了外源基因DNA的金顆粒或鎢粉微顆粒進行加速，打入完整的細胞中，從而使外源基因DNA得以在靶細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化并有可能獲得表達。實驗結(jié)果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細胞中表達。

（2）顯微注射法：在顯微鏡下，將DNA經(jīng)同細胞玻璃針直接注入細胞，該法適合于各種培養(yǎng)生長的細胞，但需要一定的設(shè)備和操作技巧。

（3）電穿孔法：電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。即利用脈沖場將DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細胞。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染很重要。

病毒作為基因轉(zhuǎn)染是基因遞送良好的工具，病毒載體的優(yōu)點有：

（1）在轉(zhuǎn)化的細胞中傳播重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分；

（2）可能將有缺陷的或突變的基因置于病毒調(diào)節(jié)信號的控制下以進行研究；

（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分，并能進行分離；

（4）轉(zhuǎn)移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因的最大容納量只有2500bp。

常用的病毒載體有下列幾種：

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA上，病毒進入細胞通過逆轉(zhuǎn)錄作用，病毒RNA即轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進入細胞核并整合在細胞染色體中，這種整合的病毒稱為原病毒。在原病毒的兩端各有一長末端重復(fù)序列（LTR），LTR內(nèi)側(cè)還有為復(fù)制所必需的其他順序，包括包裝信號。常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體有CMV和SV。

2、DNA病毒載體

主要有腺病毒相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體。這一類是利用病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性成為腫瘤基因治療的有效方法。對DNA病毒載體的研究是基因治療研究中的重點領(lǐng)域。

基本過程

被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細胞，其生長狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。

用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì)，無RNA和其它化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。DNA的質(zhì)量和純度能影響某些細胞系的轉(zhuǎn)染效率，可以通過CsCl梯度法或標(biāo)準(zhǔn)柱層析法進行純化。

病毒載體轉(zhuǎn)染過程

1.利用基因表達產(chǎn)物篩選法

（1）標(biāo)記基因篩選法???在載體上引入一個標(biāo)記基因，或同時導(dǎo)入標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時間選用合適劑量的選擇培養(yǎng)基，篩選標(biāo)記基因表型，那些已導(dǎo)入外源基因的細胞將存活下來。

（2）基因缺陷型受體細胞的選擇性?????以基因缺陷型細胞作為靶細胞，將正常基因?qū)牖蛉毕菪桶屑毎?，使用選擇性培養(yǎng)基進行篩選。

（3）基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)??將目的基因表達載體DNA和標(biāo)記基因表達載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細胞中，分別使用標(biāo)記基因和目的基因?qū)?yīng)的選擇劑進行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子。

2.分子生物學(xué)方法

外源基因是否真的轉(zhuǎn)入靶細胞必須用分子雜交方法進行證實。常用的方法有原位雜交、Southern雜交。其中主要問題是探針的選擇。

外源基因的表達和檢測

在篩選出轉(zhuǎn)化子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中外源基因的表達狀況。其中包括對目的基因和標(biāo)記基因的鑒定。常用方法有原位雜交、Northern雜交、免疫組織化學(xué)染色等，原位及Northern雜交是檢測外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA,后者則是檢測外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。

主要應(yīng)用

植物基因轉(zhuǎn)染應(yīng)用過程

2?、用于基因治療

3?、用于異種器官移植

4?、用于改良動植物品種和生產(chǎn)性能

5?、用于生產(chǎn)藥用蛋白和保健蛋白

6?、用于生產(chǎn)人抗體