無血清培養(yǎng)基（用于制備單克隆抗體等的培養(yǎng)基）

基本介紹

無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。

無血清培養(yǎng)基的基本配方：基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長。

組分簡介

1.促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

2.促生長因子及激素：針對不同細(xì)胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細(xì)胞生長、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。

3.酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。

4.結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素：硒是最常見的。

使用方法

目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時(shí)，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：

1.處于對數(shù)生長中期

2.>90% 活細(xì)胞率

3.適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法

1.直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10~3.5×10細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×10~4×10細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90%時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

2.連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

（1）以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25%SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

（2）當(dāng)細(xì)胞密度>5×10細(xì)胞/ml時(shí)，以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（3）以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

（4）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（5）每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90%時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，最好不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

主要優(yōu)缺點(diǎn)

1.可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

2.避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清組分對實(shí)驗(yàn)研究的影響。

4.有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。

5.可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。

缺點(diǎn)：

1.細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。

2.成本較高。

3.針對性很強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。

培養(yǎng)細(xì)胞配方

1.神經(jīng)細(xì)胞，干細(xì)胞，PC12細(xì)胞

成份 終濃度

葡萄糖－－0.6%

谷氨酰胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰島素－－2.5μg/ml

轉(zhuǎn)鐵蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸鈉－－30nM

青霉素－－50mg/ml

鏈霉素－－50mg/ml

最后用DF12添加到100ml即可

2.各類小鼠胚胎癌細(xì)胞系培養(yǎng)基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO2.4g

HEPES(1.5M) 10.0ul

硒酸（5*10-6M) 10.0ug

纖粘連蛋白 1ug/cm(37度作用15－30分鐘）

胰島素 1000.0ug

轉(zhuǎn)鐵蛋白 5000.0ug

3.NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制劑 0.1%

胰島素 10.0ug/ml

轉(zhuǎn)鐵蛋白 25.0ug/ml

纖粘連蛋白 5.0ug/ml

4.雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO1.2g/L

HEPES 15mM

胰島素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

轉(zhuǎn)鐵蛋白 35.5ug/ml

應(yīng)用：無血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物和無脊動(dòng)物細(xì)胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數(shù)的無血清產(chǎn)品含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質(zhì)如清蛋白，纖連蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反應(yīng)器剪切力，提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì)，作為脂類和其他生長因子的載體等。

種類分類

LONZA公司 無血清培養(yǎng)基

12-725F UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium) 500ml

產(chǎn)品簡介：一種通用的無血清培養(yǎng)劑

適用范圍：培養(yǎng)貼壁和懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞，疫苗生產(chǎn)中病毒顆粒的制備

產(chǎn)品：

77232 PC-1Complete Serum-free Medium 500ml

77230 PC-1 Complete Serum-free Medium(powder plus supplement) 10L

344022 PC-1 Supplement (50) 10ml

產(chǎn)品簡介：是一種低蛋白，無血清培養(yǎng)基。PC-1培養(yǎng)基旨在應(yīng)用于各種研究和工業(yè)用途，使用限定成份配制的培養(yǎng)基確保在維持最低蛋白成分同時(shí)使細(xì)胞獲得最佳的生長狀態(tài)。

適用范圍：培養(yǎng)原代細(xì)胞和貼壁依賴性細(xì)胞

產(chǎn)品：

12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Low-protein medium containing L-glutamine &ITES) 500ml

12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Protein-free basal medium without L-glutamine) 500ml

產(chǎn)品簡介：用于支持多種貼壁信賴性細(xì)胞在低血清濃度下的正常生長的限定培養(yǎng)基。

適用范圍：培養(yǎng)貼壁信賴性細(xì)胞

產(chǎn)品：

12-724Q UltraCHO Meidum(1*liquid with L-glutamine) 1L

12-715F UltraCHO Meidum(1*liquid without nucleosides) 500mL

17-811A UltraCHO Supplement(Non-sterile) 100ml

產(chǎn)品簡介：培養(yǎng)基最適于培養(yǎng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）細(xì)胞，表達(dá)重組蛋白質(zhì)。

適用范圍：培養(yǎng)CHO細(xì)胞; 重組蛋白的合成。

產(chǎn)品：12-749Q UltraMDCK Meida 1L

產(chǎn)品簡介：是一種無血清限定培養(yǎng)劑，適于高/低平板密度培養(yǎng)MADIN-DABBY犬腎細(xì)胞（MDCK）

適用范圍：培養(yǎng)供體外診斷（IVD）用的MDCK細(xì)胞

產(chǎn)品：

12-764Q PRO 293A-CDM 1L

12-765Q PRO 293S-CDM 1L

產(chǎn)品簡介：用于293細(xì)胞（轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞）培養(yǎng)Pro293限定培養(yǎng)基系統(tǒng)是專為促進(jìn)293細(xì)胞重組蛋白的合成和下游反應(yīng)而開發(fā)的。這些配方不需要任何動(dòng)物來源的成分即可支持高密度的培養(yǎng)

適用范圍：293細(xì)胞重組蛋白和合成

產(chǎn)品：12-730Q Insect-XPRESS Medium 1L

產(chǎn)品簡介：采用一種無蛋白配方，適合培養(yǎng)來源于Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆蟲細(xì)胞系。

適用范圍：桿狀病毒的增殖，重組蛋白的表達(dá)。

產(chǎn)品：77203 HL-1 Complete Serum-free Medium(powder) 10L

產(chǎn)品簡介：HL-1TM完全無血清培養(yǎng)基是一種限定培養(yǎng)基，蛋白含量低于30ug/ml. HL-1TM完全無血清培養(yǎng)基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。

適用范圍：雜交瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞來源的分化細(xì)胞的無血清培養(yǎng)。

產(chǎn)品：12-723 BUltraDOMA Medium 500ml

產(chǎn)品簡介：適用于中空纖維反應(yīng)器中進(jìn)行中，鼠和嵌合雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及上述細(xì)胞的批量培養(yǎng)。

適用范圍：雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，單克隆抗體的制備。

產(chǎn)品：12-727F FUltraDOMA-P.F.Protein-free Medium 500ml

08-024B Ultra DOMA-P.F.Protein-free Medium 10L

產(chǎn)品簡介：一種不含蛋白的培養(yǎng)基，適于鼠，人和嵌合細(xì)胞來源的雜交瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)。

適用范圍：雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，單克隆抗體的制備。

XVIVO系利產(chǎn)品

產(chǎn)品：

04-380Q X-VIVO 10 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-743Q X-VIVO 10 w/o Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產(chǎn)品簡介：為了有助于在無血清環(huán)境中制備淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)而設(shè)計(jì)的。

產(chǎn)品：

04-418Q X-VIVO 15 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-744Q X-VIVO 15 w/o Gentamicin or Phenol Red, 1 L

產(chǎn)品簡介：在組成上和X-VIVO 10相似，并且經(jīng)過調(diào)整優(yōu)化使之適合于無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周學(xué)及人類腫瘤中分離純化的CD3+細(xì)胞的增殖。同時(shí)還用于維持人類單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞系、粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）的生長。

產(chǎn)品：04-448Q X-VIVO 20 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產(chǎn)品簡介：經(jīng)過改進(jìn)和優(yōu)化有助于單核細(xì)胞耗竭的高密度的外周淋巴細(xì)胞制備LAK細(xì)胞。

價(jià)格：待定

存儲條件：2℃-8℃

三種培養(yǎng)的部分細(xì)胞類型應(yīng)用如下：

人和鼠淋巴因子激活殺傷細(xì)胞（LAK）；外周血淋巴細(xì)胞（PBL）；人和鼠腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）；人T細(xì)胞；人和鼠巨噬細(xì)胞；人和鼠造血干細(xì)胞（克隆形成和增殖）；人體組織的冰凍保存。

X-VIVO 產(chǎn)品的其他應(yīng)用包括：

PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰凍保存和移植；人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)；干細(xì)胞的培養(yǎng)；樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)。