蛋白質(zhì)測序（蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定）

概念介紹

保護巰基化學(xué)反應(yīng)

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。

測序要求

●1 樣品必需純（>97%以上）；

●2 知道蛋白質(zhì)的分子量；

●3 知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；

●4 測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。

●5 測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。

測定順序

●1肽鏈的拆開和分離

●2測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目

●3二硫鍵的斷裂

●4測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比

●5N端、C端的測定

●6多肽鏈斷裂

●7測定每個肽段的氨基酸順序。

●8確定肽段在多肽鏈中的次序。

●9確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

酸水解

●常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應(yīng)時間約20小時。

●此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；

●含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。

堿水解

●一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。

●由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。

●該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受破壞。

酶水解

●目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。

●應(yīng)用酶水解多肽不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。

測定步驟

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).

2 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的?-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。

二硫鍵的切割與保護（元素后數(shù)字為下標(biāo)）

a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆

－CH2SO3H

b、還原+氧化 不可逆

[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等

－S-CH2-COOH

c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

－R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

巰基（-SH）的保護

蛋白質(zhì)測序

4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比（如右圖）

5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。

6 多肽鏈斷裂成多個肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。

7 測定每個肽段的氨基酸順序

8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。