CCR5（HIV-1入侵機(jī)體的輔助受體之一）

摘要

趨化因子CCR5，以CCR5為靶點(diǎn)的HIV-1受體拮抗劑越來越受關(guān)注，主要有趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體、肽類化合物等4類。這些抗病毒活性強(qiáng)、親和力高的CCR5拮抗劑，已有一部分進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。

概況

自1981年發(fā)現(xiàn)第一例由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的傳染性疾病———獲得性免疫缺陷綜合癥（簡稱艾滋病，AIDS）以來，盡管對艾滋病的臨床治療已有了很大進(jìn)展，但是仍無有效治愈手段可以攻破此科學(xué)難題。研究表明，HIV可分為HIV-1和HIV-2兩種亞型，HIV-1致病力強(qiáng)，是引起AIDS的主要病原體。

目前已有30多種抗HIV-1藥物得到美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)，其中17種是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（包括13種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及4種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑），11種蛋白酶抑制劑，1種CCR5受體抑制劑（maraviroc），1種整合酶抑制劑（raltegravir）以及1種融合抑制劑（T20）。然而，已被批準(zhǔn)的藥物中沒有一種是可以完全抑制病毒感染的，而且由于HIV-1突變株的產(chǎn)生，大部分均對不同類型的拮抗劑具有耐藥性。此外，隨著對病毒入侵過程的深入了解，研究者發(fā)現(xiàn)，除了病毒入侵所必須的CD4受體外，重要的輔助受體如CCR5或CXCR4，在gp120與CD4識別后發(fā)生的構(gòu)象變化中起到了至關(guān)重要的作用。因此，研究者們漸漸將目光轉(zhuǎn)移到了這個(gè)新的靶點(diǎn)，目前已有幾種CCR5抑制劑正處于臨床前和臨床試驗(yàn)中，并且還有一套評價(jià)利用CCR5拮抗劑來控制HIV-1病毒感染的臨床前試驗(yàn)方法用于藥物的研究。

病毒入侵過程是一個(gè)級聯(lián)的結(jié)合與構(gòu)象變化反應(yīng)，因此，根據(jù)病毒入侵復(fù)制裂解的不同階段，拮抗劑可分為病毒入侵拮抗劑（如CD4拮抗劑、輔助受體拮抗劑）、逆轉(zhuǎn)錄酶拮抗劑、融合拮抗劑、整合酶拮抗劑、蛋白酶抑制劑等。而針對輔助受體CCR5的拮抗劑又可分為趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體、肽類化合物等4類。

趨化因子

病毒特異的CD4+T細(xì)胞是針對HIV免疫應(yīng)答的重要組成部分，也是HIV-1感染過程的首要靶點(diǎn)。自1984年發(fā)現(xiàn)HIV-1通過與CD4結(jié)合感染宿主細(xì)胞，隨后研究又發(fā)現(xiàn)僅有CD4分子并不能介導(dǎo)HIV-1的侵入，同時(shí)還需要一種或幾種輔助受體。1996年證實(shí)，趨化因子受體CXCR4和CCR5是HIV-1感染的輔助受體（coreceptor）。而在2008年2月，美國國立衛(wèi)生研究院又發(fā)現(xiàn)了另外一種新的HIV-1受體———整合素α4β7（integrinα4β7），此受體的發(fā)現(xiàn)也許可解釋為什么消化道為HIV復(fù)制的主要場所，同時(shí)為艾滋病新藥的開發(fā)指明方向。

趨化因子是一類具有趨化活性的小分子細(xì)胞因子，它的功能在于使細(xì)胞表面具有跨膜G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞聚集在一起，參與體內(nèi)的免疫平衡作用。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)人類趨化因子家族有50多個(gè)成員，根據(jù)其N?末端兩個(gè)半胱氨酸殘基的相對位置可分為4個(gè)不同結(jié)構(gòu)的家族：CXC（或α）、CC（或β）、C（或γ）和CXC3C（或δ）。盡管CCS和CXCS具有相似的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)，但是由于兩者四級結(jié)構(gòu)的差異，它們分別作用于不同的受體。趨化因子受體是屬于鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（G蛋白）偶聯(lián)的7次跨膜蛋白受體家族，根據(jù)其配體可分為CXC和CC受體。迄今已鑒定出28種趨化因子受體，其中包括6種CXCRs（CXCR1～CXCR6）、10種CCRs（CCR1～CCR10）、1種XCR、1種CX3CR。其中的趨化因子受體CXCR4與CCR5，由于它們與HIV-1的侵染有關(guān)而備受關(guān)注。幾乎所有的HIV-1病毒株都是利用其中的CCR5或CXCR4受體，或同時(shí)利用兩種輔助受體侵入細(xì)胞的。有研究表明，CCR5和CXCR4的N-末端和第二胞外區(qū)對于它們與HIV-1gp120的結(jié)合起著關(guān)鍵的作用。

利用何種趨化因子受體侵入細(xì)胞決定了HIV-1病毒株的嗜性。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞嗜性的病毒株利用趨化因子受體CCR5侵入細(xì)胞，稱為R5嗜性；T細(xì)胞嗜性的病毒株利用趨化因子受體CXCR4侵入細(xì)胞，稱為X4嗜性；而既能利用CCR5，又能利用CXCR4侵入細(xì)胞的病毒株稱為R5/X4嗜性。HIV-1gp120與何種輔助受體結(jié)合是隨著HIV-1侵入靶細(xì)胞的不同階段而有所變化的，通常在感染的初期是以CCR5為輔助受體；隨著感染程度的加深，HIV-1由R5嗜性轉(zhuǎn)化為R5/X4嗜性，而雙嗜性的HIV-1是以CXCR4為主要輔助受體的。Cocchi等人研究預(yù)測，病毒包膜蛋白的V3環(huán)與HIV-1病毒株的嗜性轉(zhuǎn)化有關(guān)，尤其是V3環(huán)中11位及25位的堿性氨基酸在不同類型病毒株中的差異可以說明一些問題。

結(jié)構(gòu)功能

CCR5是細(xì)胞內(nèi)β趨化因子（RANTES、MIP1α和MIP1β）的受體，具有調(diào)控T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的遷移、增殖與免疫的功能，主要表達(dá)于記憶性的靜止期T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞等的細(xì)胞膜上。它的分子量為40．6kDa，由352個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)上可分為：胞外N末端，3個(gè)胞外環(huán)（EL13），3個(gè)胞內(nèi)環(huán)（IL13），7個(gè)跨膜α螺旋和胞內(nèi)C末端（圖1）。CCR5除了作為HIV1早期侵染所必須的輔助受體外，有研究顯示，CCR5還對增強(qiáng)長期同種異體移植存活率發(fā)揮重要作用，CCR5拮抗劑還可以有效治療一些臨床疾病，包括器官移植、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥與糖尿病等。

從病理角度看，CCR5輔助HIV-1感染的過程是一個(gè)多區(qū)域參與的復(fù)雜過程，gp120和CCR5的相互作用可能遵循兩步結(jié)合機(jī)制：第1步，CCR5的N末端區(qū)域采取恰當(dāng)?shù)臉?gòu)象識別并結(jié)合gp120；第2步，gp120與CCR5的構(gòu)象發(fā)生變化，CCR5的第二胞外區(qū)與gp120的V3區(qū)相互作用，最終導(dǎo)致膜融合和病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。CCR5作為HIV-1的重要輔助受體參與膜融合過程，其N末端和EL2主要與gp120相互作用，而N末端對于HIV-1的感染來說是必需的。CCR5與趨化因子或gp120的結(jié)合位點(diǎn)是相互獨(dú)立的，或者有部分重疊，產(chǎn)生的不同功能主要是通過極性、疏水性氨基酸的三維構(gòu)象的細(xì)微調(diào)整來實(shí)現(xiàn)。此外，gp120、趨化因子和各類CCR5拮抗劑在CCR5上的結(jié)合位點(diǎn)也并不完全相同。

從基因角度看，在CCR5基因中存在的多個(gè)突變體能夠有效抵抗HIV的病毒感染以及延緩病情的惡化。目前已在此基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多種有意義的突變，尤其以對基因編碼區(qū)突變體CCR5△32的研究最為廣泛，CCR5△32是指CCR5基因的32個(gè)堿基缺失的突變，即在CCR5等位基因編碼區(qū)域第185位氨基酸密碼子以后發(fā)生了32個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致讀碼框架錯(cuò)位，缺失了與G蛋白信號通路相關(guān)的胞外第三環(huán)結(jié)構(gòu)，從而使CCR5蛋白無法正常穿膜表達(dá)于細(xì)胞膜上，進(jìn)而使HIV1的gp120不能與CCR5△32有效結(jié)合，使HIV1病毒不能進(jìn)入宿主細(xì)胞。人群調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，CCR5△32缺失的個(gè)體擁有正常的免疫功能和炎癥反應(yīng)，并且對HIV-1的感染表現(xiàn)出顯著的抵御能力，因此，作用于CCR5的抑制劑將有效阻斷HIV?1感染。

從氨基酸組成上看，通過點(diǎn)突變方法并聯(lián)用了病毒侵染試驗(yàn)來進(jìn)行基于CCR5同源模型的預(yù)測以及分析其中的30個(gè)氨基酸殘基的功能，研究者發(fā)現(xiàn)一組關(guān)鍵的芳香族和脂肪族氨基酸殘基具有與配體結(jié)合的疏水性核心。這些發(fā)現(xiàn)為解釋拮抗劑與CCR5如何作用提供了一個(gè)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。對于小分子非肽類CCR5拮抗劑而言，CCR5的7個(gè)跨膜區(qū)域（H1～H7）與小分子拮抗劑的作用過程相關(guān)，跨膜結(jié)構(gòu)域中的酸性氨基酸尤其是一些芳香族和脂肪族氨基酸，它們通過H1～H3和H7的螺旋區(qū)線性形成一個(gè)用于小分子拮抗劑結(jié)合的小腔。

拮抗劑

CCR5作為HIV?1受體拮抗劑的理想靶點(diǎn)，其拮抗劑藥物抑制R5嗜性的HIV?1感染細(xì)胞的機(jī)制是，它們與CCR5結(jié)合后，使CCR5構(gòu)象發(fā)生變化不利于gp120的識別或者導(dǎo)致CCR5的內(nèi)源化作用（internalization），阻斷了HIV?1與細(xì)胞包膜蛋白結(jié)合，導(dǎo)致HIV?1與CCR5在細(xì)胞表面結(jié)合的數(shù)量減少，從而起到抗感染作用。同時(shí)，有些學(xué)者擔(dān)憂靶向于CCR5輔助受體的抗病毒治療是否會加快R5嗜性病毒株向X4嗜性病毒株的轉(zhuǎn)變。在體外實(shí)驗(yàn)中顯示，除了一種耐藥株產(chǎn)生嗜性轉(zhuǎn)換外，大部分對CCR5拮抗劑產(chǎn)生耐藥的HIV?1突變株仍然保持原先的輔助受體嗜性。而且臨床上有限的數(shù)據(jù)積累亦顯示，已開發(fā)的CCR5拮抗劑在臨床試驗(yàn)中還未發(fā)現(xiàn)有加快耐藥株嗜性轉(zhuǎn)換的病例。因此，CCR5拮抗劑的應(yīng)用是不會加劇病情的惡化反應(yīng)。目前，主要的CCR5受體拮抗劑有以下幾種。

β趨化因子（RANTES，MIP?1α及MIP?1β）作為CCR5的天然配體是HIV?1受體當(dāng)然的拮抗劑，在一定程度上可以保護(hù)細(xì)胞免受HIV?1的感染，其主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)了CCR5的內(nèi)吞作用（endocytosis）。然而，由于天然趨化因子具有半衰期短（<10min）以及潛在的炎癥應(yīng)答作用，它們作為拮抗劑藥物并不是很合適。也有報(bào)道顯示，高濃度的CC?趨化因子能夠減緩病情的惡化，但是Marozsan等研究人員同時(shí)也發(fā)現(xiàn)高濃度的CC?趨化因子也可通過活化細(xì)胞而增強(qiáng)HIV?1的感染。而且Mosier等人發(fā)現(xiàn)CC?趨化因子也可促進(jìn)R5嗜性病毒株向X4嗜性病毒株的轉(zhuǎn)換以致病情加劇。因此與天然的配體相比，趨化因子衍生物通過不誘導(dǎo)信號通路而使受體內(nèi)化的方式阻斷相應(yīng)的受體表位而更具優(yōu)越性。

RANTES（3?68）是缺失了RANTES的N?末端2個(gè)氨基酸殘基的CCR5拮抗劑，具有抑制R5嗜性HIV?1侵入的活性；RANTES（9?68）是缺失了RANTES的N?末端8個(gè)氨基酸殘基的CCR5拮抗劑，但是相比于RANTES（3?68）的抑制活性較低；AOP（氨基氧戊烷）?RANTES是通過將AOP基團(tuán)偶聯(lián)到RANTES的氨基末端得到的一個(gè)很強(qiáng)的CCR5拮抗劑，在AOP?RANTES的作用下，CCR5被修飾后內(nèi)吞，細(xì)胞表面的表達(dá)量不可逆地減少，因此具有抑制R5病毒株感染的作用，并且沒有誘導(dǎo)趨化的功能。此外，以RANTES為基礎(chǔ)的修飾衍生物還有（NNY）?RANTES，Met?RANTES，PSC?RANTES。其中以PSC?RANTES的特異性阻斷R5HIV?1的作用最強(qiáng)，其抗病毒能力是AOP?RANTES的50倍左右。Lederman等利用嵌合性猿/人免疫缺陷病毒SHIVSF162（R5嗜性）進(jìn)行研究的結(jié)果證實(shí)，PSC?RANTES能有效地防止HIV通過陰道途徑傳播。幾乎所有的RANTES修飾衍生物均具有使CCR5受體內(nèi)源化并下調(diào)細(xì)胞表面的CCR5表達(dá)量的作用，從而達(dá)到潛在的抗病毒活性。LD78β（CCL3L1）是MIP?1α的同種型，兩者的區(qū)別是僅有3個(gè)氨基酸不同，但是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放及增強(qiáng)細(xì)胞趨化作用的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于MIP?1α和RANTES，它能特異性地與CCR5結(jié)合，可以下調(diào)CCR5在人類單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的表達(dá)，抑制R5病毒株的感染，編碼CCL3L1的基因拷貝數(shù)的多少影響細(xì)胞對HIV的易感性，拷貝數(shù)越少，細(xì)胞的病毒感染率越高；而此后研發(fā)的AOP?LD78β具有比AOP?RANTES高10倍的抑制病毒入侵活性，因此可能是最有效的趨化因子衍生物。2002年又發(fā)現(xiàn)，HCC?1（人類CC趨化因子1）的蛋白水解產(chǎn)物HCC?1作用于CCR5的EL2，它可以促進(jìn)T淋巴母細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的趨化作用和Ca2+釋放，同時(shí)也能介導(dǎo)CCR5內(nèi)吞作用。熒光細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示，HCC?1能使CCR5在細(xì)胞表面的表達(dá)量下降75%，并且高濃度的HCC?1具有很強(qiáng)的抗HIV?1的活性。vMIP?I，vMIP?II及vMIP?III是由人皰疹病毒8（humanherpesvirus8，HHV?8）編碼的病毒性趨化因子，它們與巨噬炎癥因子（MIP?1α）有25%～40%個(gè)氨基酸的相似性，與炎癥免疫應(yīng)答相關(guān)。Boshoff等人于1997年在Science發(fā)表研究顯示，vMIP?I和vMIP?II均具有拮抗HIV?1入侵有關(guān)的輔助受體的作用。其中，vMIP?I主要作為CCR8的顯效劑，但Willey等人研究發(fā)現(xiàn)vMIP?I也可在輔助受體缺失或被封閉的情況下抑制HIV?1病毒的入侵；vMIP?II可以與CC和CXC趨化因子受體作用并抑制由CCR1，CCR2，CCR5，CCR8，CXCR4和XCR1介導(dǎo)的HIV?1入侵，可阻斷正常血流狀態(tài)下人微靜脈內(nèi)皮固定的RANTES誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和Th1的牢固粘附和跨膜移動；而vMIP?III主要作為XCR1的顯效劑發(fā)揮作用。

目前以非肽類小分子化合物CCR5拮抗劑的研究占據(jù)主導(dǎo)地位，這類小分子拮抗劑不具有潛在的炎癥應(yīng)答效應(yīng)，并且具有比生產(chǎn)小分子蛋白成本低，可通過靜脈注射方式給藥的優(yōu)勢，但是它也具有不能下調(diào)受體表達(dá)的缺點(diǎn)。非肽類小分子化合物CCR5拮抗劑的抑制效果還與細(xì)胞的類型和細(xì)胞表面的CCR5濃度相關(guān)。非肽類小分子化合物拮抗劑主要有TAK?779，TAK?220，TAK?652，SCH?351125（SCH?C），SCH?417690（SCH?D），GW873140，maraviroc（UK?427875），NIBR?1282和AMD3451等幾種。在小分子CCR5拮抗劑的研究中，許多生物制藥公司參與了進(jìn)來。TAK?779是日本Takeda公司研發(fā)的第一種CCR5小分子拮抗劑，主要用于以CCR5為靶點(diǎn)的抗HIV藥物研究。它屬于季銨衍生物，可以阻斷膜融合階段gp120與CCR5的結(jié)合，其作用位點(diǎn)在受體的細(xì)胞外側(cè)面，跨膜α螺旋1，2，3，7形成的袋狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，這說明CCR5的跨膜結(jié)構(gòu)域同樣是拮抗劑可以選擇的位點(diǎn)。臨床研究表明，TAK?779有很強(qiáng)的CCR5拮抗作用，可阻止CCR5介導(dǎo)的鈣離子信號傳導(dǎo)；它還能抑制利用CCR5進(jìn)行膜融合的R5型HIV?1在外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中的增殖，從而起到抗HIV?1的作用。但是由于它的可變抗病毒活性和低效的口服生物有效性，它并不是一種好的抗HIV?1藥物。此外，基于TAK?779的其它兩種小分子拮抗劑有TAK?220和TAK?652，它們均具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，其中TAK?652已進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)。而吡咯烷類化合物TAK?220，它能與CCR5上的4，5，6跨膜區(qū)結(jié)合，只抑制RANTES和MIP?1α與CCR5結(jié)合，不抑制MIP?1β與CCR5作用，選擇性高，在小鼠和猴中的口服利用度分別為9．5%和28．5%，而且藥代動力學(xué)性質(zhì)很好，在小鼠淋巴液中的濃度是在其血漿中的2倍，現(xiàn)也已進(jìn)入Ⅰ期臨床研究。SCH?351125（SCH?C）是小分子肟哌啶類化合物，是高特異性的CCR5拮抗劑，對CCR5有很高的親和性，它與CCR5的1，2，3，7跨膜區(qū)結(jié)合從而改變CCR5胞外區(qū)的構(gòu)象，本身并不誘導(dǎo)Ca2+釋放，但可以有效地拮抗RANTES的誘導(dǎo)作用，嚙齒類和靈長類動物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，SCH?351125的口服生物利用度為50%～60%，血漿半衰期為5～6h，R5病毒株的復(fù)制顯著減少，它是第一個(gè)進(jìn)入臨床的小分子CCR5拮抗劑。SCH?351125進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)在高濃度時(shí)有延長心臟QT間期的副作用，因此對SCH?351125進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造后得到一系列化合物，如基于SCH?351125的衍生物小分子拮抗劑SCH?417690（SCH?D），它們具有比SCH?351125高10倍的拮抗活性。目前由Schering Plough公司開發(fā)的SCH?417690已進(jìn)入了臨床Ⅲ期試驗(yàn)。體外活性實(shí)驗(yàn)證明，SCH?417690具有比SCH?351125更強(qiáng)的活性（大約10倍的生物活性），且無心血管反應(yīng)。SCH?417690具有很好的藥物動力學(xué)特性，100%的生物藥效率，84%的藥物結(jié)合率，而且不會引起對肝臟酶類的抑制反應(yīng)。SCH?417690是趨化因子RANTES的一種拮抗劑，當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)會相互干擾對方的結(jié)合活性。

AMD3451屬于CCR5/CXCR4的拮抗劑，是第一個(gè)對CCR5與CXCR4受體都進(jìn)行拮抗的小分子抑制劑。研究顯示，AMD3451對R5嗜性、X4嗜性及R5/X4嗜性的細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抗病毒活性。它能抑制CXCR4受體的配體因子SDF?1和CCR5的配體因子RANTES引發(fā)的胞內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)作用。NIBR?1282是一種CCR5的新型拮抗劑，動物實(shí)驗(yàn)顯示，此拮抗劑具有良好的口服活性，并且在10mmol/L的高劑量下對心臟也不會產(chǎn)生不利的的影響。

GW873140作為一種新的螺環(huán)二酮哌啶類小分子拮抗劑，是由GSK公司開發(fā)的。此拮抗劑能有效阻斷gp120/CCR5復(fù)合體的形成，以及具有對HIV?1很強(qiáng)的抑制活性。藥物代謝動力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，在嚙齒類動物中，GW873140具有較好的口服有效性。但是2005年Nichols等發(fā)現(xiàn)GW873140具有嚴(yán)重的肝毒性反應(yīng)而停止了其Ⅲ期臨床研究。另一種有效的小分子拮抗劑maraviroc是由Pfizer公司開發(fā)的萘啶酰胺類化合物，本品可口服，吸收快，通常在口服后0.5～4h內(nèi)達(dá)到最高血藥濃度，目前是唯一被FDA批準(zhǔn)上市的CCR5拮抗劑。

在 對小分子非肽類CCR5拮抗劑的研究開發(fā)過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)一些基團(tuán)的有效添加或修飾將會極大地增強(qiáng)藥物抑制活性及吸收率。如Masaki發(fā)現(xiàn)，在含有2?吡啶基團(tuán)的硫氧化合物中，其間的咪唑基團(tuán)對于增強(qiáng)抑制活性十分重要。并且經(jīng)過進(jìn)一步的化學(xué)修飾后，如以咪唑基團(tuán)或1，2，4?三咪唑基團(tuán)代替吡啶基團(tuán)將會增強(qiáng)拮抗劑的結(jié)合活性。而像1999年誕生的第一支非肽類小分子CCR5拮抗劑TAK?779，它具有低的口服吸收率的缺點(diǎn)，這是由于部分四價(jià)的銨根離子的結(jié)構(gòu)只適于皮下注射，但是改進(jìn)三價(jià)銨鹽衍生物的化學(xué)修飾方式以代替四價(jià)銨鹽將極大提高口服的效率。此外，由于此藥物中銨鹽的組成可能是導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的主要原因，科學(xué)家通過將無銨鹽結(jié)構(gòu)組成的TAK?779和金納米粒子結(jié)合起來的方法進(jìn)行了有關(guān)的實(shí)驗(yàn)，從而消除銨鹽的負(fù)影響，實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一結(jié)合不僅加大了此藥物阻止HIV病毒感染實(shí)驗(yàn)室培育的白血球的能力，還消除了此藥物的副作用。Shankaran也發(fā)現(xiàn)，小分子雜環(huán)上的合適替代基團(tuán)和乙酸側(cè)鏈上的烷基取代基將增加小分子拮抗劑的抗病毒活力。

Shinichi也發(fā)現(xiàn)，小分子化合物中的極性基團(tuán)是拮抗劑與輔助受體高效結(jié)合所必需的。在對小分子拮抗劑結(jié)合模式的研究中發(fā)現(xiàn)，不同的拮抗劑與CCR5的結(jié)合部位并不相同。而且，不同HIV?1病毒株對不同小分子拮抗劑的敏感性也不一樣。結(jié)合于CCR5跨膜區(qū)的不同小分子化合物將非競爭性地阻斷gp120與CCR5的結(jié)合。小分子抑制劑通過插入CCR5跨膜區(qū)并與之結(jié)合而影響了CCR5的H3和H6跨膜螺旋區(qū)域的位移，而此螺旋區(qū)域恰是CCR5活性所必須的部位。這就勢必會影響CC?趨化因子的結(jié)合作用，對此現(xiàn)象的一種解釋是拮抗劑深入與跨膜區(qū)域的結(jié)合可能阻斷了趨化因子的N?末端與CCR5的作用，另一個(gè)解釋是拮抗劑與CCR5的深入結(jié)合誘導(dǎo)了CCR5的構(gòu)象變化而不利于趨化因子的結(jié)合。因此，為了保留CCR5天然趨化因子的生理活性，設(shè)計(jì)的小分子拮抗劑應(yīng)該避免深入插進(jìn)CCR5的跨膜螺旋束而導(dǎo)致CCR5活性的喪失。

CCR5存在多種構(gòu)象及可變性，從構(gòu)象上的多種變化上看，CCR5的膜外具有一個(gè)N?末端及三個(gè)胞外環(huán)，它可以為單克隆抗體提供多個(gè)抗原表位的識別位點(diǎn)，因此CCR5mAbs可以識別CCR5上的多種不同的結(jié)合表位。研究表明，CCR5的單克隆抗體與不同的受體表位結(jié)合且能產(chǎn)生不同的抑制效應(yīng)。盡管已有多種CCR5mAbs被報(bào)道，已知的單克隆抗體類的CCR5拮抗劑主要有PRO140，mAb004，2D7，3A9，ROAb12，ROAb13，ROAb14，ROAb18和CCR?02等，但是具有有效的抗病毒活性的單克隆抗體卻相當(dāng)少。其中僅PRO140與mAb004具備較強(qiáng)的抗病毒活性，目前正處于臨床Ⅰ期試驗(yàn)階段。而2D7正處于前期臨床開發(fā)階段。CCR5mAbs作為拮抗劑，它具有人體對藥物的不適應(yīng)性，潛在的過敏反應(yīng)，不能使輔助受體內(nèi)源化，易產(chǎn)生耐藥株及中和抗？抗體的缺點(diǎn)，但是它也具有高靶向?qū)Ｒ恍?，較長的胞質(zhì)半衰期，利用了不同的代謝途徑，不會干擾小分子拮抗劑的結(jié)合等優(yōu)勢。幾乎所有的小分子拮抗劑均顯示具有抑制CCR5天然配體結(jié)合及發(fā)揮功能的作用，而CCR5mAbs具有不同的抗病毒和抗趨化的活性，因此可以協(xié)同小分子拮抗劑發(fā)揮抗病毒的活性。

PRO140，是鼠源的單克隆抗體，覆蓋于CCR5的多個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，在不影響CCR5趨化因子受體功能的情況下，具有封閉CCR5的功能，能夠有效抑制HIV?1的粘附。PRO140有諸多優(yōu)點(diǎn)，除能與CCR5進(jìn)行多價(jià)結(jié)合，在血漿中半衰期較長以外，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，HIV?1在PRO140的抑制作用下，很少產(chǎn)生抗性病毒株，使PRO140成為非常有治療前景的藥物。單克隆抗體2D7，可與CCR5的EL?2結(jié)構(gòu)域（EL?2A：Lys?171/Glu?172）特異性結(jié)合，并且高效識別細(xì)胞表面的CCR5分子，能夠最大化地中和HIV，從而起到抗R5嗜性病毒株感染的作用；CCR5?02則是CCR5N?末端結(jié)構(gòu)域特異性的單克隆抗體，它不干擾天然趨化因子如RANTES的結(jié)合及其正常生理功能，不下調(diào)細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)，不干擾gp120?CCR5的結(jié)合作用，而是使CCR5形成二聚體導(dǎo)致構(gòu)象的變化來阻斷HIV?1的感染。單克隆抗體與CCR5的結(jié)合部位同小分子拮抗劑并不相同，單克隆抗體主要識別CCR5EL?2表位，而且它主要在阻斷gp120結(jié)合的后續(xù)步驟中發(fā)揮作用，如CCR5的構(gòu)象變化以及CCR5的寡聚化過程，具有與小分子拮抗劑不同的阻斷機(jī)制。

CCR5肽類拮抗劑與單克隆抗體一樣可與輔助受體CCR5的胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域識別，但又不同于小分子拮抗劑產(chǎn)生的毒性作用，肽類拮抗劑能夠特異性地與CCR5的特定胞外結(jié)構(gòu)結(jié)合而產(chǎn)生抑制作用，不會產(chǎn)生毒性作用，安全性好，但它也具有不穩(wěn)定易被消化降解的缺點(diǎn)。目前，噬菌體肽庫的篩選技術(shù)是肽類化合物篩選的重要方法，同時(shí)這種肽類化合物也是拮抗劑研究的一個(gè)理想方向。通過噬菌體肽庫的篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)的與蛋白靶點(diǎn)具有高親和力和特異性結(jié)合的肽，具有制造費(fèi)用較低、活性較高（15～60倍）、穩(wěn)定性較高、與免疫系統(tǒng)發(fā)生不相關(guān)相互作用的機(jī)會較少、器官和腫瘤穿透性較好等優(yōu)點(diǎn)，甚至可以和抗體相媲美，成為生物制藥中一種可靠替代品。

2003年上市的T20是一種衍生于HIV病毒的跨膜蛋白gp140的643～678號氨基酸的含有36個(gè)氨基酸的小肽，是一種融合抑制劑，它具有抑制gp41糖蛋白的構(gòu)象變化從而阻斷膜融合的作用。而早于輔助受體的發(fā)現(xiàn)，T?肽（DAPTA）已被證明具有無毒性的抗HIV?1的活性。T?肽是gp120V2（185～192位氨基酸）的衍生物，它對R5嗜性HIV?1病毒株的抑制機(jī)制是通過與HIV包膜蛋白競爭性結(jié)合CCR5來阻斷了gp120/CD4與CCR5的相互作用。此外還有一些衍生于CCR5本身結(jié)構(gòu)的多肽也具有抑制gp120與CCR5的作用。S?肽是含有CCR5的N?末端22個(gè)氨基酸的多肽化合物，其中第10位和第14位的酪氨酸經(jīng)硫酸化修飾，另外第20位的Cys也被換成了Ser。研究提示，S?肽的結(jié)合位點(diǎn)可能位于gp120表面的CCR5結(jié)合區(qū)域，它通過干擾gp120與CCR5的結(jié)合而阻斷HIV?1的侵入。環(huán)十二肽cDDR?MAP是衍生于CCR5第二胞外環(huán)的Arg168～Thr177的小分子環(huán)肽，它在N?末端及C?末端分別加入Asp，Gly，并使之連接成環(huán)，模擬了CCR5的EL2的關(guān)鍵區(qū)域的十二肽的構(gòu)象，從而誘導(dǎo)構(gòu)象特異性抗體的產(chǎn)生，通過抗體和細(xì)胞表面表達(dá)的CCR5相互作用以及cDDR?MAP本身與HIV?1的gp120直接相互作用聯(lián)合抑制R5嗜性病毒株的感染。王芳宇等采用噬菌體展示技術(shù)，從噬菌體隨機(jī)12肽庫篩選到與CCR5 特異結(jié)合的親和短肽（AFDWTFVPSLIL）。并初步證明該序列與CCR5的第二外環(huán)（ECL2）具有特異性結(jié)合作用，同時(shí)該短肽對RANTES以及抗CCR5單克隆抗體同時(shí)具有競爭結(jié)合和封閉gp120的結(jié)合作用。

問題展望

輔助受體CCR5是目前抗HIV-1感染的首選靶點(diǎn)，因此對HIV?1利用輔助受體（CCR5和CXCR4）侵入靶細(xì)胞機(jī)制的逐步闡明將有利于更有效地研制出抗HI藥物。不同的輔助受體在不同類型的細(xì)胞中存在不同的構(gòu)像，因此作為一個(gè)抑制趨化因子受體發(fā)生作用的試劑，它應(yīng)該能夠識別與結(jié)合該受體的不同結(jié)合位點(diǎn)或不同的構(gòu)象，并且不會影響輔助受體天然的趨化因子配體的正常生理功能。研究已經(jīng)證實(shí)不同類型的CCR5拮抗劑具有不同的阻斷機(jī)制。小分子拮抗劑通過改變CCR5EL-2構(gòu)象使之不能識別HIV?1的V3區(qū)達(dá)到抑制的效果；而CCR5的單克隆抗體拮抗劑識別CCR5的Nt表位并有效阻斷gp120結(jié)合于輔助受體，但不阻斷病毒的入侵；相反，具有識別不同表位的兩種單克隆抗體能高效阻斷病毒入侵卻并不能阻斷gp120的結(jié)合。研究者們認(rèn)為，判斷拮抗劑抗病毒活性的標(biāo)準(zhǔn)不是單一地看拮抗劑與CCR5的結(jié)合親和力，其它的一些指標(biāo)如拮抗劑從CCR5上分離的速率及其它一些生理特性也十分重要。

盡管輔助受體拮抗劑可有效預(yù)防HIV-1感染，遏制AIDS的流行，但是該類抑制劑的發(fā)展也面臨著挑戰(zhàn)。長期使用一種抑制劑，最終會使HIV-1產(chǎn)生耐藥性，不幸的是，幾乎所有的小分子拮抗劑都會產(chǎn)生耐藥性，也有實(shí)驗(yàn)顯示，耐藥株的產(chǎn)生與HIV-1gp120的200個(gè)氨基酸組成有關(guān)。通過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明gp120C2?V5結(jié)構(gòu)域（271～386位氨基酸）的關(guān)鍵作用，Westby等人發(fā)現(xiàn)V3的315～317位氨基酸殘基的缺失與小分子拮抗劑UK?427，857相關(guān)。所以，開發(fā)有效且防止耐藥性病毒株產(chǎn)生是當(dāng)前各類拮抗劑需要面對的關(guān)鍵問題。由于趨化因子（RANTES，MIP-1α及MIP-1β）受體CCR5與gp120的接觸涉及多個(gè)位點(diǎn)（N-末端，EL，TM），因此與其單一位點(diǎn)相互作用的CCR5拮抗劑的發(fā)展空間有限；而針對CCR5上多個(gè)位點(diǎn)的疫苗及其誘生的抗體將對CCR5起到屏蔽作用，使其失去充當(dāng)HIV-1輔助受體的能力，并且不會對人體的正常生理功能產(chǎn)生影響，因此針對輔助受體多位點(diǎn)的拮抗劑研究將是大勢所趨。此外，為了研制更具耐藥性的抗HIV藥物，或許將輔助受體抑制劑（尤其是CCR5拮抗劑）與病毒生命周期其它環(huán)節(jié)的抑制劑如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和融合抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，可以最大程度抑制病毒復(fù)制，并且聯(lián)合用藥是將來治療AIDS的主要方向。