體內(nèi)藥物分析是由藥物分析學(xué)派生出來(lái)的一門(mén)學(xué)科。它是通過(guò)分析人或動(dòng)物體液及各組織器官中藥物及其代謝物濃度,了解藥物在體內(nèi)數(shù)量和質(zhì)量的變化,獲得藥物代謝動(dòng)力學(xué)的各種參數(shù)和轉(zhuǎn)變,以及代謝的方式、途徑等信息,從而有助于藥物的研究、臨床合理應(yīng)用等。

中文名

體內(nèi)藥物分析

定義

藥物濃度直接與藥效相關(guān)

學(xué)科關(guān)聯(lián)

體內(nèi)藥物分析學(xué)科發(fā)展

學(xué)科特點(diǎn)

樣品成分復(fù)雜,被測(cè)組分含量低

學(xué)科介紹

基本概念

體內(nèi)藥物濃度,尤其是血漿(或血清)藥物濃度直接與藥效相關(guān),并受多種因素影響。例如,不同給藥途徑(如口服、吸人、靜脈注射、肌肉注射、透皮等)可直接影響藥物的吸收、分布、代謝和排泄,從而影響體內(nèi)藥物的濃度以及經(jīng)時(shí)行為,并最終影響療效?;颊叩纳硪蛩兀ㄐ詣e、年齡等),病理狀態(tài)(疾病的類(lèi)型和程度),基因類(lèi)型,吸收、代謝及分泌排泄功能,都影響藥物在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)行為。許多藥物需經(jīng)肝臟代謝或經(jīng)腎臟排泄,所以對(duì)于肝或腎病患者,由于他們的肝臟生物轉(zhuǎn)化及代謝功能降低、或腎臟的分泌排泄功能降低,往往會(huì)造成藥物在體內(nèi)蓄積,進(jìn)而發(fā)生藥物毒性反應(yīng)。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步,人們對(duì)醫(yī)療質(zhì)量也提出了更高的要求。治療藥物監(jiān)測(cè)(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)就是以靈敏可靠的方法,檢測(cè)病人在給藥后的血液或其他體液中的藥物濃度,并應(yīng)用藥物代謝動(dòng)力學(xué)理論,指導(dǎo)最適個(gè)體化用藥方案的制定和調(diào)整,以避免用藥劑量過(guò)大及可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng),保證藥物治療的有效性和安全性。

學(xué)科特點(diǎn)

體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)是樣品成分復(fù)雜,被測(cè)組分含量低。

學(xué)科關(guān)聯(lián)

體內(nèi)藥物分析學(xué)科發(fā)展的最大推動(dòng)力來(lái)自于生物醫(yī)學(xué)及新藥藥物動(dòng)力學(xué)研究領(lǐng)域巨大的要求和分析技術(shù)上的飛躍性進(jìn)步。與藥代動(dòng)力學(xué)、臨床藥理學(xué)和生物藥劑學(xué)等學(xué)科互相關(guān)聯(lián)、密不可分。

分析方法

光譜分析法

包括比色法(colorimetry)、紫外分光光度法(UV )和熒光分析法(Fluor )。光譜法雖然儀器簡(jiǎn)單、測(cè)定快速,但選擇性和靈敏度都較低,本法不具備分離功能,受結(jié)構(gòu)相近的其他藥物、代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,因此用光譜法分析體液樣品時(shí),除少數(shù)樣品外,一般都需經(jīng)過(guò)組分分離、純化等預(yù)處理過(guò)程。光譜法的靈敏度低,不適用于測(cè)定藥物濃度低的生物樣品。

色譜分析法

包括高效液相色譜法(HPLC )、氣相色譜法(GC )及其與質(zhì)譜(Ms )聯(lián)用(HPLC 一MS , GC 一MS )的方法,以及毛細(xì)管電泳色譜法( HPCE )。

色譜法具有對(duì)組分進(jìn)行分離和分析的雙重作用,能排除與藥物結(jié)構(gòu)相近的代謝產(chǎn)物和某些內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,具有很高的選擇性和較高的檢測(cè)靈敏度,常作為評(píng)價(jià)其他方法的參比方法。在某些情況下色譜法應(yīng)用也受到一定限制,如HPLC 大多數(shù)儀器配備的是紫外和熒光檢測(cè)器,只限于測(cè)定具紫外吸收或產(chǎn)生熒光的組分,雖然對(duì)某些組分可通過(guò)衍生化方法使之具備紫外吸收或熒光性質(zhì),這勢(shì)必增加測(cè)定時(shí)的操作步驟。又如用GC 法測(cè)定生物樣品時(shí),還受被測(cè)組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。此外,對(duì)于測(cè)定濃度很低的樣品(如地高辛有效血藥濃度僅0 . 9 一2 . 2 拌g / L )時(shí),色譜法的靈敏度難以達(dá)到要求。

免疫分析法

包括放射免疫分析法(RIA )、酶免疫分析法(EIA )和熒光免疫分析法(EIA )。

免疫分析是利用半抗原藥物與標(biāo)記藥物競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合原理的一種分析方法,具有快速、簡(jiǎn)便和靈敏度高的特點(diǎn),尤其適用于分析低藥物濃度的體液樣品及大量又需長(zhǎng)期分析(如常規(guī)監(jiān)測(cè))的樣品。該法可直接測(cè)定體液樣品,并且耗費(fèi)樣品量少。免疫分析法建立時(shí),需針對(duì)每一種藥物制備特異性的抗體和標(biāo)記藥物,費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,在一般實(shí)驗(yàn)室中難于辦到。目前通常采用試劑盒(又稱藥盒),但測(cè)定的藥物品種受試劑盒供應(yīng)的限制。

同位素標(biāo)記

藥物它們主要應(yīng)用于放射免疫分析法(RIA) 、同位素逆稀釋分析,或作為GC - MS 分析中的內(nèi)標(biāo),以及在藥物分離中作示蹤應(yīng)用等。

微生物測(cè)定

利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用,比較樣品與藥物標(biāo)準(zhǔn)品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小,借以測(cè)定樣品內(nèi)抗生素的濃度。

樣品種類(lèi)

體內(nèi)樣品包括各種體液和組織。但是,在體內(nèi)藥物分析中最為常用的樣本是血液,它能夠較為準(zhǔn)確地反映藥物在體內(nèi)的狀況。尿液中常含有豐富的藥物代謝物,也被較多地使用。唾液因采集便利,且有時(shí)與血漿游離藥物濃度具有相關(guān)性而時(shí)有使用。而臟器組織,除非特別需要,在臨床治療藥物監(jiān)測(cè)中很少使用。

采集時(shí)間

體內(nèi)樣品的采集時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的臨床價(jià)值影響很大,是開(kāi)展臨床治療藥物監(jiān)測(cè)必須考慮的基本問(wèn)題。采集時(shí)間應(yīng)在藥代動(dòng)力學(xué)理論的指導(dǎo)下,根據(jù)臨床治療藥物監(jiān)測(cè)的不同目的確定。

用藥方案的確定和調(diào)整是開(kāi)展臨床治療藥物監(jiān)測(cè)的主要工作。應(yīng)該在用藥達(dá)到穩(wěn)態(tài)后再采樣,以保證穩(wěn)態(tài)血藥濃度是否維持在治療濃度范圍內(nèi),以鞏固療效或控制癥狀的發(fā)作。

對(duì)于用藥已達(dá)療效、但需了解長(zhǎng)期用藥是否會(huì)致慢性毒性時(shí),也需要進(jìn)行臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。取樣宜在達(dá)穩(wěn)態(tài)后的血藥峰濃度時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行,以確定穩(wěn)態(tài)峰濃度是否接近或超過(guò)中毒濃度,以便做出相應(yīng)處理。

急性藥物中毒診斷時(shí),應(yīng)立即取樣測(cè)定。治療效果監(jiān)測(cè)則可根據(jù)臨床需要確定取樣時(shí)間,監(jiān)測(cè)劇藥效果。

臨床藥代動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)研究時(shí),大都采集給藥前及給藥后,藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和消除排泄各階段多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本,以便獲得完整的經(jīng)時(shí)行為,為臨床用藥提供參考。

血樣

血液樣品

血樣 包括全血(whole blood)、血漿(plasma)和血清(serum),它們是最為常用的體內(nèi)樣品。血藥濃度監(jiān)測(cè),除特別說(shuō)明是全血外,通常都是指血漿或血清中藥物濃度的測(cè)定。當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí),血漿中藥物的濃度能夠反映藥物在靶器官的狀況,因而,血漿藥物濃度可作為體內(nèi)藥物濃度的可靠指標(biāo)。

1.血樣(全血)的采集

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí),可直接從動(dòng)脈或心臟取血。對(duì)于患者或志愿者,通常采集靜脈血,有時(shí)根據(jù)血藥濃度和分析方法的靈敏度,也可用毛細(xì)管采血。血樣的采集時(shí)間由測(cè)定目的和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)決定。全血采集后置含有抗凝劑(例如:肝素、EDTA、草酸鹽、枸櫞酸鹽等,防止凝血后影響測(cè)定)的試管中,混合均勻,即得。血漿或血清由采集的全血制備。

2.血漿的制備

將采集的全血置含有抗凝劑的試管中,混勻后,以約1000×g力離心5~10分鐘,促進(jìn)血紅細(xì)胞沉降分離,分取上清液即為血漿。

3.血清的制備

將采集的全血在室溫下放置至少0.5~1小時(shí),待血液凝固后,再以約600×g力離心5~10分鐘,促進(jìn)血細(xì)胞沉降分離,分取上清液即為血清。

因?yàn)樗幬锱c血漿纖維蛋白幾乎不結(jié)合,所以,血漿與血清中藥物的濃度通常相同。血漿比血清分離快、制取量多(約為全血的50%),因而較血清更為常用。如果抗凝劑對(duì)藥物可能發(fā)生作用,并對(duì)藥物濃度測(cè)定產(chǎn)生干擾,則以血清為檢測(cè)標(biāo)本。

血樣采集后應(yīng)及時(shí)分離血漿或血清,并最好立即進(jìn)行分析。如不能立即進(jìn)行測(cè)定,應(yīng)根據(jù)藥物在血樣中的穩(wěn)定性及時(shí)處置,置于具塞硬質(zhì)玻璃試管或聚塑管(Eppendorf)中密塞保存。短期保存時(shí)可置冰箱冷藏(4℃),長(zhǎng)期保存時(shí)需在-20℃或-80℃下冷凍貯藏,以保障樣本不變質(zhì)和藥物穩(wěn)定,保障監(jiān)測(cè)濃度的準(zhǔn)確。因冰凍有時(shí)可引起細(xì)胞溶解,妨礙血漿或血清的分離;或因溶血影響藥物濃度變化;所以全血未經(jīng)分離時(shí),不宜直接冷凍保存。

如果待測(cè)藥物在樣本中易受酶或酸堿等的作用發(fā)生進(jìn)一步變化,則須根據(jù)其自身性質(zhì)選擇合適的方法進(jìn)一步處置。通常的處置方法包括低溫冷凍、調(diào)節(jié)酸堿度、加酶抑制劑等。

尿液

尿液樣品

尿液 包括隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時(shí)間尿幾種。健康成人一日排尿量為1~5L,尿液的pH值在4.8~8.0之間。尿液的主要成分是水、含氮化合物(其中大部分是尿素)及鹽類(lèi)。

體內(nèi)藥物清除主要是通過(guò)腎臟排泄,經(jīng)尿液排出。采集的尿液應(yīng)該是自然排尿。尿液在放置時(shí)可因細(xì)菌繁殖而變混濁,因此,尿液采集后應(yīng)立即測(cè)定。若不能立即測(cè)定(如需收集24小時(shí)的尿液),必須采集后立即處置、或低溫保存、或加入防腐劑后冷藏保存。常用的防腐劑有二甲苯、三氯甲烷、醋酸或鹽酸等。二甲苯等有機(jī)溶劑可以在尿液的表面形成薄膜,醋酸等可以改變尿液的酸堿性,以抑制細(xì)菌的繁殖。保存時(shí)間在36小時(shí)以內(nèi),可置冰箱冷藏;若需長(zhǎng)時(shí)間保存,則應(yīng)冰凍貯藏。

藥物可以原型(母體藥物)或代謝物及其綴合物(conjugates)等形式排出。尿液中藥物濃度大都較高,采集方便、且采集量大,但尿液濃度通常變化較大。所以,尿液藥物濃度測(cè)定的目的通常與血液或唾液樣品的不同,主要用于藥物尿液累積排泄量、尿清除率或生物利用度的研究,以及藥物代謝物及其代謝途徑、類(lèi)型和速率等的研究。在臨床上,亦可推斷患者是否違反醫(yī)囑用藥。

尿液中藥物濃度的改變不能直接反映血藥濃度,即與血藥濃度相關(guān)性差。受試者的腎功能正常與否直接影響其對(duì)藥物的排泄能力,因而,尿液樣品的采集和測(cè)定應(yīng)當(dāng)與腎功能指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。嬰兒的排尿時(shí)間難于掌握,且尿液不易采集完全。

測(cè)定尿液中藥物濃度時(shí)應(yīng)采用時(shí)間尿(一定時(shí)間區(qū)間的尿液)。測(cè)定尿液中藥物的總量時(shí),應(yīng)收集用藥后一定時(shí)間內(nèi)(如24小時(shí),或至基本完全排泄的其他時(shí)間)各時(shí)間段排泄的全部尿液,記錄體積后,量取一部分用于藥物濃度的測(cè)定,再乘以尿液量,計(jì)算即可求得尿藥排泄總量。

唾液

唾液是由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔黏膜腺體分泌的黏液在V1腔里混合而成的消化液。一般成人每天分泌約1~1.5L.口腔黏膜受到機(jī)械或化學(xué)刺激時(shí),各唾液腺的分泌會(huì)受到影響,造成唾液組成發(fā)生較大的變化;感官刺激所產(chǎn)生的條件反射以及思維、情緒也會(huì)影響唾液腺的分泌;隨年齡不同,唾液的分泌量也不同:小兒的唾液分泌量多,老年人的分泌量減少。通常得到的唾液含有黏蛋白,其黏度是水的1.9倍。唾液的pH值受分泌量變化的影響,分泌量增加時(shí)趨向堿性而接近血液的pH值,其波動(dòng)范圍為6.2~7.6.

唾液的采集應(yīng)盡可能在安靜狀態(tài)下進(jìn)行。一般在漱口后15分鐘收集,1分鐘內(nèi)大約可采集1ml.唾液采集后應(yīng)立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積,并以1000×g力離心10分鐘,分取上清液作為藥物濃度測(cè)定的樣品。

若分泌量少,可轉(zhuǎn)動(dòng)舌尖促進(jìn)唾液的分泌;也可采用物理的(如嚼石蠟塊)或化學(xué)的(如維生素C、酒石酸)等方法刺激,使在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的唾液。但經(jīng)刺激后唾液中的藥物濃度往往會(huì)受到影響。特殊需要時(shí),可采集腮腺、頜下腺及舌下腺分泌的單一唾液。這種單一唾液的采集必須采用特殊唾液采集器收集。

唾液采集后,應(yīng)在4℃以下保存。若分析時(shí)無(wú)影響,則可用堿處理唾液,以使黏蛋白溶解而降低其黏度。冷凍保存的唾液在解凍后應(yīng)充分?jǐn)噭蚝笤偈褂?,以避免因濃度不均勻而產(chǎn)生測(cè)定誤差。

樣品處理

處理目的

治療藥物監(jiān)測(cè)中,除少數(shù)方法可以對(duì)采集的樣品直接進(jìn)行分析外,大多需要對(duì)樣品進(jìn)行必要的預(yù)處理。預(yù)處理的目的是在不破壞待測(cè)定成分的前提下,用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x純化或濃縮待測(cè)藥物,以減少干擾、提高檢測(cè)靈敏度和特異性、降低對(duì)儀器的污染和損害。所以,體內(nèi)樣品的預(yù)處理是體內(nèi)樣品分析的重要環(huán)節(jié)。

常用方法

體內(nèi)樣品的預(yù)處理方法的選擇需要綜合考慮多種因素,包括體內(nèi)樣品的種類(lèi)、被測(cè)藥物的性質(zhì)和濃度、以及所采用的測(cè)定方法等三方面。

如血漿或血清需除蛋白,使藥物從蛋白結(jié)合物中釋出;尿液樣品則常采用酸或酶水解使藥物從綴合物中釋出;唾液樣品主要采用離心去除黏蛋白沉淀。

被測(cè)定藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、存在形式與濃度范圍等,均直接影響到樣品前處理方法的選擇與應(yīng)用。例如,藥物的酸堿性(pKa)與溶解性影響到藥物的萃取分離條件的選擇,藥物的極性、穩(wěn)定性、官能團(tuán)性質(zhì)和光譜特性影響到其色譜測(cè)定條件的優(yōu)化選擇。不同藥物在樣品中的濃度相差懸殊,濃度大的樣品對(duì)前處理要求稍低,濃度越低則樣品前處理要求越高。

體內(nèi)樣品前處理的方法以及分離純化的程度,均取決于測(cè)定要求和所采用的測(cè)定方法。測(cè)定方法的耐受污染程度和抗干擾能力越強(qiáng)、專(zhuān)屬性越好、靈敏度越高,則對(duì)前處理的要求越低。通常,免疫測(cè)定法由于具有較高的靈敏度和抗干擾能力,體內(nèi)樣品只需經(jīng)離心分離即可直接用于測(cè)定。而高效液相色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法,為防止蛋白質(zhì)等在色譜柱上沉積、內(nèi)源性干擾、或基質(zhì)效應(yīng)影響,色譜分析前均需對(duì)體內(nèi)樣品進(jìn)行去除蛋白、溶劑萃取、甚至制備衍生物等前處理。

1.去除蛋白質(zhì)法

在測(cè)定血樣及組織勻漿等樣品中的藥物時(shí),首先應(yīng)去除蛋白質(zhì)。去除蛋白質(zhì)既可使蛋白結(jié)合型的藥物釋放出來(lái)以便測(cè)定藥物的總濃度,又可避免進(jìn)一步的溶劑萃取過(guò)程中乳化的形成,并可消除內(nèi)源性干擾,同時(shí)保護(hù)儀器性能(如保護(hù)HPLC柱不被蛋白污染),延長(zhǎng)使用壽命。去除蛋白質(zhì)常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。

2.綴合物水解法

藥物在體內(nèi)經(jīng)二相代謝可以形成葡糖醛酸苷或硫酸酯綴合物,并經(jīng)尿液或膽汁排泄。為了準(zhǔn)確測(cè)定體內(nèi)樣品中藥物的含量,首先需將綴合物水解釋放出綴合的藥物或其代謝物后,再進(jìn)行進(jìn)一步的處理測(cè)定。常用的綴合物水解方法包括酸水解和酶水解。

酸水解通常使用無(wú)機(jī)酸,如鹽酸或磷酸溶液等。酸的濃度、水解時(shí)間和溫度等條件,應(yīng)根據(jù)具體藥物進(jìn)行優(yōu)化確定。酸水解的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速,但是專(zhuān)屬性較差,并需注意避免藥物的進(jìn)-步降解。對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物,可采用酶水解法。

酶水解法常用葡糖醛酸苷酶或硫酸酯酶,或二者的混合物。酶解時(shí)應(yīng)當(dāng)注意控制反應(yīng)的pH、酶試劑用量、孵育溫度、酶解時(shí)間,并在厭氧條件下進(jìn)行。尿液樣本進(jìn)行酶解時(shí),需要首先隱蔽會(huì)抑制酶活力的陽(yáng)離子。

雖然酶水解法存在水解時(shí)間長(zhǎng)、酶試劑帶人的黏液蛋白可能導(dǎo)致乳化及色譜柱污染等缺點(diǎn),但酶水解法具有較高的選擇性,很少使被測(cè)藥物或共存物發(fā)生降解,所以常被優(yōu)先選用。

3.分離純化與濃集法

對(duì)于濃度較高的樣品,或檢測(cè)方法具有足夠靈敏度時(shí),體內(nèi)樣品在經(jīng)去除蛋白質(zhì)或綴合物水解等前處理步驟后即可直接用于測(cè)定。但當(dāng)藥物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度不夠高時(shí),體內(nèi)樣品需進(jìn)行分離、純化與濃集處理,或在去除蛋白質(zhì)或綴合物水解的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行處理。

萃取法是應(yīng)用最多的分離、純化方法。萃取的目的是為了從大量共存的內(nèi)源性物質(zhì)中分離出所需要的微量組分一藥物及其代謝物,并通過(guò)溶劑的蒸發(fā)使樣品得到濃集,殘留物采用適宜的溶劑復(fù)溶后再進(jìn)行分析測(cè)定。萃取法包括液-液萃取法和液-固萃取法。

4.化學(xué)衍生化法

治療藥物監(jiān)測(cè)的體內(nèi)樣品色譜分析時(shí),可根據(jù)待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和檢測(cè)方法的要求,通過(guò)化學(xué)衍生化方法,特異性地引入功能基團(tuán)后再進(jìn)行分析。通常對(duì)藥物分子中含有活潑H的極性基團(tuán),如含-COOH、-0H、-NH2、-NH-和-SH等,進(jìn)行化學(xué)衍生化?;瘜W(xué)衍生化的目的包括:改變待測(cè)藥物的色譜行為;增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性;改善(手性拆分)分離能力;提高檢測(cè)靈敏度等。

GC分析中常對(duì)待測(cè)物進(jìn)行硅烷化(silylation)、?;?a class="dict" href="/know/2819765/">acylation)、烷基化(alkylation)或酯化(esterification)等。硅烷化應(yīng)用最廣泛。硅烷化試劑有:三甲基氯硅烷(TMCS)、雙-三甲基硅烷乙酰胺(BSA)、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基硅烷咪唑(TMTS)等。?;噭┯校阂宜狒?、丙酸酐、五氟苯甲酸酐等。烷基化及酯化試劑有:五氟碘乙烷、重氮甲烷、對(duì)溴芐基溴、三氟化硼-甲醇等。

化學(xué)衍生化HPLC分析包括柱前和柱后衍生化兩種方法。柱前衍生化分析中,衍生化胺、氨基酸和氨基醇類(lèi)化合物的試劑有:丹酰氯、熒光胺、9-芴甲氧羰酰氯、鄰苯二醛等;衍生化羰基化合物的試劑有:2,4-二硝基苯肼、丹酰肼等;衍生化羧酸常用的試劑為2,4'-二溴苯乙酮;衍生化醇類(lèi)化合物常用的試劑為3,5-二硝基苯甲酰氯、五氟苯甲酰氯等。

由于柱前衍生化法是在分離前使藥物與衍生化試劑反應(yīng)。故與藥物具有相同官能團(tuán)的干擾物質(zhì)也同樣會(huì)生成衍生物,并有可能妨礙藥物的檢測(cè)。如果干擾物質(zhì)含量高時(shí),甚至?xí)绊懘郎y(cè)成分的衍生化效率。因此,應(yīng)盡可能將樣品進(jìn)行分離純化后再衍生化。

柱后衍生化是藥物經(jīng)色譜分離后在流出液中進(jìn)行衍生化,以形成對(duì)檢測(cè)器具有高靈敏度響應(yīng)的衍生物,從而提高檢測(cè)靈敏度。如氨基酸分析儀中的柱后茚三酮衍生化。

具有光學(xué)異構(gòu)體的藥物,由于R(-)與S(+)構(gòu)型的不同,使之具有不同的藥效和藥動(dòng)學(xué)特性。因此,異構(gòu)體的分離檢測(cè)十分重要。光學(xué)異構(gòu)體的分離可采用不對(duì)稱試劑衍生化,使其生成非對(duì)映異構(gòu)體衍生物,再進(jìn)行色譜分離測(cè)定。常用的不對(duì)稱衍生化試劑有:(-)-1-(9-芴基)乙基氧甲酰氯、(+)-樟腦磺酰氯、2,3,4,6-四-O-苯甲酰-β-D-葡萄吡喃糖基異硫氰酸酯、(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺等。

樣品測(cè)定

常用方法

體內(nèi)樣品分析常用的方法有免疫分析法和色譜分析法。

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應(yīng)而建立起來(lái)的一種生物化學(xué)分析法。具有很高的選擇性和很低的檢出限,可以應(yīng)用于測(cè)定各種抗原、半抗原或抗體。免疫分析法分為熒光免疫法、發(fā)光免疫法、酶免疫法及電化學(xué)免疫法等非放射免疫法和放射免疫法,測(cè)定的量可以達(dá)到μg甚至ng的水平。這些分析方法多配有專(zhuān)用設(shè)備和試劑,操作相對(duì)簡(jiǎn)便,適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室使用,多應(yīng)用臨床治療藥物監(jiān)測(cè)。

色譜分析包括:氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS、LC-MS)等,這些方法適用于復(fù)雜樣品中微量藥物的專(zhuān)屬準(zhǔn)確定量,多用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。

定量分析

由于體內(nèi)樣品取樣量少、藥物濃度低、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾(如無(wú)機(jī)鹽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、代謝物)及個(gè)體差異等多種因素影響體內(nèi)樣品測(cè)定,為了保證方法的可靠性,必須在建立體內(nèi)樣品分析方法的同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

(一)特異性

必須證明所測(cè)定的物質(zhì)是原形藥物或特定的活性代謝物,內(nèi)源性物質(zhì)和相應(yīng)的代謝物及同時(shí)服用的其他藥物不得干擾樣品的測(cè)定。對(duì)于色譜法至少要提供6個(gè)不同來(lái)源的空白體內(nèi)樣品色譜圖、空白體內(nèi)樣品外加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖(注明濃度)及用藥后的體內(nèi)樣品色譜圖。

(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

根據(jù)所測(cè)定物質(zhì)的濃度與響應(yīng)的相關(guān)性,用回歸分析方法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低濃度范圍為線性范圍,在線性范圍內(nèi)濃度測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度。

必須用至少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,應(yīng)使用與待測(cè)樣品相同的生物介質(zhì),線性范圍要能覆蓋全部待測(cè)濃度,不允許將線性范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)隨行空白體內(nèi)樣品,但標(biāo)準(zhǔn)曲線不包括零點(diǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線上各濃度點(diǎn)的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值的偏差(bias)在可接受范圍內(nèi)時(shí),可判定標(biāo)準(zhǔn)曲線合格。偏差可按下式計(jì)算:

式中,回歸值系將各濃度點(diǎn)的響應(yīng)值代人標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的濃度值;標(biāo)示值系指制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),各相應(yīng)濃度點(diǎn)的配制濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線上各濃度點(diǎn)偏差的可接受范圍一般規(guī)定為:最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi),在其余各濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)。只有合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線才能用于臨床待測(cè)樣品的濃度計(jì)算。當(dāng)線性范圍較寬時(shí),推薦采用加權(quán)最小二乘法(weighted least square method)進(jìn)行同歸計(jì)算。

(三)定量下限

定量下限(LLOQ)是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn),:要求至少能滿足測(cè)定3~5個(gè)半衰期時(shí)樣品中的藥物濃度,或Cmax的1/10~1/20時(shí)的藥物濃度,其準(zhǔn)確度應(yīng)在真實(shí)濃度的80%~120%范圍內(nèi)。RSD應(yīng)小于20%,S/N應(yīng)大于5.應(yīng)由至少5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試結(jié)果證明。

(四)精密度與準(zhǔn)確度

要求選擇高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控(quality control,QC)樣品同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證。其中,低濃度接近定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ),在LLOQ的3倍以內(nèi);高濃度接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限(即定量上限,upper limit of quantitation,ULOQ),中間選一個(gè)濃度,每一濃度至少測(cè)定5個(gè)樣品。

精密度用QC樣品的批內(nèi)(intra-batch)和批間(inter-batch)RSD表示,RSD一般應(yīng)小于15%,在LLOQ附近應(yīng)小于20%.

在測(cè)定批內(nèi)RSD時(shí),每一濃度至少制備并測(cè)定5個(gè)樣品。為獲得批間RSD應(yīng)至少在不同天連續(xù)制備并測(cè)定3個(gè)分析批,至少45個(gè)樣品。

準(zhǔn)確度是指用特定方法測(cè)得的體內(nèi)樣品濃度與真實(shí)濃度的接近程度,一般應(yīng)在85%~115%范圍內(nèi),在LLOQ附近應(yīng)在80%~120%范圍內(nèi)。

(五)樣品穩(wěn)定性

根據(jù)具體情況,對(duì)含藥體內(nèi)樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時(shí)間進(jìn)行穩(wěn)定性考察,以確定體內(nèi)樣品的存放條件和時(shí)間。還應(yīng)注意考查儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性,以保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

(六)提取回收率

應(yīng)考察高、中、低3個(gè)濃度的提取回收率。其結(jié)果應(yīng)一致、精密和可重現(xiàn)。

(七)質(zhì)控樣品

質(zhì)控(QC)樣品系將已知量的待測(cè)藥物加入到生物介質(zhì)中配制的樣品,用于質(zhì)量控制。

(八)質(zhì)量控制

應(yīng)在體內(nèi)樣品分析方法驗(yàn)證完成之后開(kāi)始測(cè)試未知體內(nèi)樣品,每個(gè)樣品一般測(cè)定一次,必要時(shí)進(jìn)行復(fù)測(cè)。每個(gè)分析批均應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并隨行測(cè)定高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品,每個(gè)濃度至少雙樣本。并應(yīng)均勻分布在未知樣品測(cè)試順序中。當(dāng)一個(gè)分析批中未知樣品數(shù)目較多時(shí),應(yīng)增加各濃度QC樣品數(shù),使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%,QC樣品數(shù)的增加以組(高、中、低3個(gè)濃度)為單位。QC樣品測(cè)定結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)為:偏差應(yīng)小于15%,低濃度點(diǎn)偏差應(yīng)小于20%,最多允許1/3不在同一濃度的QC樣品結(jié)果超限。如QC樣品測(cè)定結(jié)果不符合上述要求,則該分析批未知樣品測(cè)試結(jié)果作廢。濃度高于ULOQ的未知體內(nèi)樣品,應(yīng)采用相應(yīng)的空白介質(zhì)稀釋后重新測(cè)定。

(九)測(cè)試結(jié)果

應(yīng)詳細(xì)描述所用的分析方法,引用已有的參考文獻(xiàn),提供每個(gè)分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品及未知樣品的測(cè)試結(jié)果及計(jì)算過(guò)程。還應(yīng)提供全部未知樣品分析的色譜圖,包括全部相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品的色譜圖,以供審查。

學(xué)科應(yīng)用

(一)治療藥物監(jiān)測(cè)的對(duì)象

對(duì)于治療安全濃度范圍窄、治療劑量與中毒劑量接近、毒副作用強(qiáng)、具有非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征、長(zhǎng)期使用藥效和毒性不明確、以及聯(lián)合用藥可能發(fā)生相互作用的藥物,通常都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。應(yīng)當(dāng)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)的藥物包括部分抗癲癇藥、抗心律失常藥、強(qiáng)心苷類(lèi)藥、抗生素、抗精神病藥、抗哮喘藥、抗惡性腫瘤藥和一些解熱鎮(zhèn)痛藥,如表7-1所示。部分應(yīng)當(dāng)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)的藥物的治療濃度范圍和中毒濃度,如表7-2所示。治療藥物監(jiān)測(cè)示例見(jiàn)第十章第一節(jié)“苯巴比妥體內(nèi)樣品的分析。

(二)在藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

地高辛在臨床上用于心衰治療,其有效濃度(0.8~2.0ng/ml)與中毒濃度(>2.4ng/ml)接近。消除半衰期長(zhǎng),成人的約為36小時(shí)、兒童的約為30小時(shí),屬一級(jí)動(dòng)力學(xué)。地高辛在腸部被吸收,60%~90%以原型經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)或腎小管排泌,僅有約10%在體內(nèi)通過(guò)氫化、水解、結(jié)合等反應(yīng)代謝,另有約7%發(fā)生腸-肝循環(huán)。

以毛地黃毒苷為內(nèi)標(biāo),對(duì)人血漿和尿液中地高辛濃度LC-MS測(cè)定如下。

(1)樣品處理方法

精密吸取血漿1.0ml,置具塞離心管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(20ng/ml)50μl,加濃氨水100μl和甲基叔丁基醚5.0ml,振蕩混勻30分鐘后,3000×g力離心10分鐘,分取有機(jī)層,置另一離心管中,在減壓離心條件下?lián)]千,殘留物用100μl 含0.25mmol/L醋酸鈉的甲醇-水(40:60)流動(dòng)相溶解,14000×g力離心2分鐘,取上清液15μl進(jìn)行LC-MS分析。尿樣用空白血漿按1:10或1:50稀釋后照血漿方法處理和測(cè)定。

2)色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱C8(2.1mm×50mm,5μm)柱,流動(dòng)相含0.25mmol/L醋酸鈉的甲醇(A)-水(B)梯度洗脫,流速0.25ml/min.電噴霧正離子化,噴霧電壓5000V,傳輸裂解電壓250V,干燥氮?dú)鉁囟?50℃,流速10.0L/min,噴霧口氣壓25psi.選擇性離子【M+Na】+監(jiān)測(cè)(SIM),m/z分別為803.4(地高辛)和787.4(毛地黃毒苷)。

(3)測(cè)定結(jié)果

血漿濃度線性范圍為0.05~1.5ng/ml,應(yīng)用于人體藥代動(dòng)力學(xué)研究,測(cè)得女性受試者口服0.25mg地高辛后的典型血漿濃度-時(shí)間曲線如圖7-2所示,其尿液48小時(shí)累積排泄量為30.2%。