聚丙烯酰氨凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)的電泳技術(shù)）

簡介

聚丙烯酰氨凝膠電泳

在蛋白質(zhì)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開；在DNA的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，DNA呈雙鏈狀態(tài)泳動，其遷移率會受堿基組成和序列的影響。

在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，由于加入了變性劑——蛋白質(zhì)變性劑常為SDS（SDS-PAGE），核酸變性劑常為尿素、甲酰胺等，故其分離僅依據(jù)于分子量大小。蛋白質(zhì)的SDS-PAGE技術(shù)最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子表面活性劑和強還原劑（SDS，即十二烷基硫酸鈉）后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?。SDS是陰離子去表面活性劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。

SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成一穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。

此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。

補充信息

聚丙烯酰氨凝膠電泳

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCl。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。

過程

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為18A(1A=10的負十次方米），這樣的蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小由于蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設(shè)計提純過程都是非常重要的。

常見問題

⒈ 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？

在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。

所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素，當(dāng)然其他的因素也可以從多方面考慮。

⒉ 樣品如何處理？

根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或β-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中

3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用

⒊ SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.8，分離膠選擇pH8.8，選擇Tris－HCl系統(tǒng)，TEMED與AP：AP 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP催化作用；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

⒋ 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。

⒌“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。

⒍ “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

⒎ 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。此外可能是灌膠時分離膠過多導(dǎo)致濃縮膠很少，不能起到濃縮作用，沒有把樣品壓成一條線。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度；灌膠時分離膠不要過多。

⒏ 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

⒐ 什么是“鬼帶”，如何處理？

“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

⒑ 為什么溴酚藍不能起到指示作用？

我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

⒒ 為什么電泳的條帶很粗？

電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當(dāng)降低電壓；

⒓ 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

處理辦法：電泳槽正確裝配即可。

⒔ 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？

這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。

⒕ 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？

通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。

⒖ 電泳時間比正常要長？

可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。

⒗分離膠加上后為什么要立即加水？

加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。

⒘連續(xù)分離膠體系配制（凝膠板厚度0.75mm，長度10cm）100ml體系：雙蒸水37.5ml

尿 素20--50g

10×TBE緩沖液8ml

30%丙烯酰胺10ml

APS（過硫酸銨）500--800ul [注：現(xiàn)配現(xiàn)用]

TEMED（四甲基乙二胺） 23.5ul

原理

1．聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（以后簡稱單體）在水溶液中聚合而成的親水性高聚物，是一種透明而不溶于水并有韌性的凝膠。

2．制備凝膠時需要的原料是：丙烯酰胺，亞甲基雙丙烯酰胺（雙體，用作交聯(lián)劑）o在水溶液中用催化劑引發(fā)聚合。常用的催化劑有：二甲氨基丙腈（DMAPN）；過硫酸銨，四甲基乙二胺；過硫酸銨或加核黃素后用紫外光（波長253．7毫微米）引發(fā)聚合。

3．聚合時丙烯酰胺分子通過加成反應(yīng)形成長鏈，雙體的作用是在長鏈之間形成交聯(lián)，成為具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠（見圖1）。所以在凝膠電泳中除了具有電泳的分離外還具有分子篩作用，從而增高了它的分辨能力。

4．聚合時，根據(jù)分離的需要，可以用改變單體溶液濃度或增減雙體比例的辦法制成孔度大小不同的凝膠。在分離血清蛋白時，我們采用的丙烯酰胺總濃度為

5．聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝膠具有良好的親水性，能在水中溶脹但不溶解。

實驗材料

一．設(shè)備

進行凝膠電泳的裝置見圖版4。

1）直流電源如果一次進行電泳的管數(shù)在20管以內(nèi)可以用最大電流300毫安的整流器（硅或硒整流器），調(diào)壓范圍0—300伏。

2）電泳裝置包括二個緩沖液槽和電泳管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部鉆孔。插入電泳管，用有孔橡皮塞固定。電泳管選用孔徑均勻一致的玻璃管切制。長10厘米，內(nèi)徑 ^5毫米。脫色用玻璃管長10厘米，內(nèi)徑8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。

3）凝膠管架灌裝凝膠管時使管保持垂直位置，用有機玻璃制成。

二．操作方法

1）凝膠管的制備將電泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝膠溶液（方法見下文）。每管加至液體高度為7．5厘米。為了保證凝膠表面平整可用注射器通過細針頭小心地加一層（高約1厘米）蒸餾水于表面上，勿使與凝膠液混合，室溫放置。如果條件合適溶液于 30—60分鐘內(nèi)聚合而成凝膠。凝膠溶液的配制方法如下：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重結(jié)晶）25克，雙體（甲醇重結(jié)晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要時用三羥甲基氨基甲烷調(diào)pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羥甲基氨基甲烷0．85克（也可用0．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：

2）準(zhǔn)備把已灌裝凝膠的玻管通過有孔椽皮塞安裝在上面液槽的底孔中，在上下兩槽內(nèi)分別注入緩沖液。裝上后電泳管下端應(yīng)浸沒在下槽的緩沖液中，管下端勿留氣泡。血清電泳可以用巴比妥緩沖液pH一8．6，離子強度0．05（配法：巴比妥鈉10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，溫?zé)崾谷?。加硫柳?．1克防霉）。

3）加樣在資料介紹的方法中，一般還在了這一步。在血清樣品中加入少量蔗糖以增加密度，用血紅蛋白吸管直接小心地加在凝膠表面上，加樣量一般為7微升血清。如果在樣品中混入少量溴酚蘭指示劑就可以在電泳過程中觀察前沿移動的情況。

4）電泳在二液槽中安放鉑金絲電極；正極在下，負極在上。接通電源進行電泳，電場強度10伏/厘米左右，視室溫高低而定。室溫較高時宜用較低的電壓以免發(fā)熱過度影響分離。蛋白質(zhì)向正極移動。侍染料前沿移動至管底近處，停止電流。電泳時間為1一2小時。電泳完畢取下凝膠管，用細長針頭沿管壁注蒸餾水，使凝膠與管壁剝開。然后用橡皮球壓出凝膠條。

5）染色及脫色電泳后的凝膠條在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小時以上。染色后的凝膠條用7%醋酸洗滌數(shù)次。置于脫色玻管中，在同一電泳裝置中電解脫色。此時改用7%醋酸充裝在液槽中。通電后過剩凝膠之上再加一層大孔凝膠，樣品聚合在最后的另一層凝膠中（圖2）。在我們的試驗中省略的染料泳向正極。脫色時電場強度25伏/厘米，電流10—1 5毫安/管。3—4小時脫色完畢。增高電壓可以加速脫色。有色的醋酸溶液通過盛有活性炭的漏斗過濾，即可除去染料，重新使用。

6）保存與記錄脫色后的凝膠可以裝在盛有7%醋酸的有塞試管中保存數(shù)年。也可以自然干燥后保存，在需要觀察時再浸在7%醋酸中溶脹成原來形狀。記錄可以用照相攝影。也可以用光密度計進行捕記。光密度計的分辨力決定于其狹縫寬窄及光電管放大倍數(shù)。

三、實驗結(jié)果

1．電泳條件的選擇

為了選擇血清蛋白電泳較合適的條件，我們分別對單體濃度、雙體濃度、配制凝膠時所用不同正離子、各種電壓、二甲氨基丙腈的濃度、過硫酸銨的濃度等條件進行了試驗。根據(jù)以上試驗結(jié)果，我們在分離血清蛋白時選用的條件是：單體濃度

2．人血清及其酒精分劃部分的凝膠電泳

采用上述條件我們進行了正常人血清的凝膠電泳。一般可以分成15—20條區(qū)帶。我們也根據(jù)RaFmand介紹的兩向電泳方法比較了紙電泳和凝膠電泳各區(qū)帶的相對關(guān)系。紙電泳上的a：區(qū)帶在凝膠電泳中可被分離成10條以上區(qū)帶。但紙電泳中d，區(qū)帶的一部分則與凝膠電泳中自蛋白區(qū)帶相重合。二種電泳方法所得的圖譜見圖版9。在正常人血清中后白蛋白（PA）、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tr）和觸珠蛋白（HP）均有不同的型，一例骨髓瘤病人血清的和凝膠電泳自由電泳圖譜的比較見圖版11、12。我們也比較了酒精分劃人血漿各部分的紙電泳和凝膠電泳圖譜，結(jié)果見圖版13。從圖中可見在紙上電泳檢定時看來較純晦白蛋白和丙種球蛋白部分，在凝膠電泳中可見明顯的其他蛋白區(qū)帶。

3．放射病狗血清蛋白電泳的觀察 放射病動物血清蛋白的改變可以在紙電泳中觀察到。一般認為狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝膠電泳觀察可以得到更深入的資 料。正常狗血清的凝膠電泳圖譜大致與人相 似。狗受致死量照射后第九天有明 顯變化，至極期時則可以觀察到鴨、Tr、融及 sp等區(qū)帶有明顯增高。我們用胎3—10型光 譜儀用光密度計將電泳圖譜進行了掃描，所得 結(jié)果見圖3，圖版14。由于儀器的限制光縫 最小只能達到0．5毫米，從而影響了其分辨力。但與正常血清對比可以見到其改變的情況，這 遠比紙電泳中所見更為明顯。我們認為如果聯(lián) 系臨床表現(xiàn)對變化的本質(zhì)進行一些研究，將有 助于了解放射病極期來到前后體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的一些情況。

4．在分離正常人尿DNase時的凝膠電泳 觀察 用葡聚糖凝膠分離人尿中DNase時可以除去大部分其他蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。但分離所得的制品用凝膠電泳觀察還可以見到五條以上的蛋白質(zhì)區(qū)帶（見圖版14）。將凝膠條在未染色前置于含大分子DNA的瓊脂平板上，在

四、結(jié) 論

本文介紹了聚丙烯酰胺凝膠電泳的一些初步實驗條件和實驗結(jié)果，并與紙電泳、自由電泳等進行了對比。從結(jié)果中可以看到聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨力較強，重演性良好。它在臨床生化分析及生物活性物質(zhì)的分離、制備中和純度鑒定中具有較廣泛應(yīng)用的可能性。