非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（用于酶鑒定、提純等的實驗）

實驗原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性SDS-PAGE電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時候，要利用低pH凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋白時候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會帶負電荷，蛋白會向陽極移動；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進行，蛋白帶正電荷，這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離堿性蛋白。

實驗器材與試劑

1、電泳儀、電泳槽、離心機等

2、丙烯酰胺、Tris、HCl、溴酚藍、ABTS等

實驗步驟

1、PAGE膠電泳緩沖液配置

1）丙烯酰胺單體貯液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，先用40mL雙蒸水攪拌溶解，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀至50mL，過濾。用棕色瓶4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

2)濃縮膠緩沖液貯液(0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8)：3.03gTris溶解在40mL雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調pH6.8。再用雙蒸水稀至50mL。保存在4°C備用。

3)分離膠緩沖液貯液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9)：18.16gTris溶解在80mL雙蒸水中，用4mol/L鹽酸調pH8.9。再用雙蒸水稀至100mL，保存在4°C備用。

4)10%（AP）過硫酸銨：0.1g過硫酸銨溶入1.0mL雙蒸水，使用前新鮮配制。

5)電極緩沖液(0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3)：15.14gTris加上72.07g甘氨酸，用雙蒸水稀釋到5L?？稍谑覝乇４嬉粋€月。

6）樣品緩沖液（0.1mol/L Tris-HCl，pH6.8）：2ml濃縮膠緩沖液貯液加上1mL87%甘油、0.1mg溴酚藍，用雙蒸水稀釋至10mL，可在-20°C保存6個月。

2、Native-PAGE配方

3、Native-PAGE電泳

將玻璃板、膠墊、梳子用雙蒸水洗干凈，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配制分離膠(12%)和濃縮膠(5%)如表1。過硫酸銨和TEMED最后加入，加入后聚合即開始，應立即混勻倒入兩塊玻璃板之間。分離膠倒入兩塊玻璃板間，應該留下適合的高度，使點樣孔前端離分離膠有2.5cm左右的距離，在膠頂部緩緩加入約0.5cm高的雙蒸水，待分離膠聚合完全后，傾去上層的雙蒸水，用雙蒸水清洗凝膠頂層，用吸水紙吸去殘余的水滴。將濃縮膠倒入玻璃板夾層，插上梳子，待濃縮膠聚合完全后，拔去梳子，立即用雙蒸水清洗點樣孔。加入電極緩沖液，將樣品用微量進樣器點入點樣孔底部，200伏電泳。當溴酚藍到達分離膠時，電壓改為250伏，繼續(xù)電泳至溴酚藍到達凝膠底部。將凝膠剝下，浸泡在100ml的底物液中，染色1小時，待膠帶顯色后立即照相。然后將凝膠進行常規(guī)的考馬斯亮藍染色。

結果與分析

記錄和觀察電泳過程中的溫度變化，電泳完后進行活性染色時凝膠有色條帶的變化。對比活性染色和常規(guī)的考馬斯亮藍染色后凝膠中蛋白質條帶的變化。

注意事項

1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，蛋白質的遷移率不僅和蛋白質的等電點有關，還和蛋白質的分子量以及分子形狀有關，其中蛋白質的等電點是最重要的影響因子，要根據(jù)蛋白質的等電點來選擇對應的電泳緩沖系統(tǒng)；

2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，要注意電壓過高引起發(fā)熱而導致蛋白質變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度；

3. 蛋白質的分子量較大，則電泳時間可以適當延長，以使目的蛋白質有足夠的遷移率和其它的蛋白質分開，反之亦然;

4. 變性樣品的離子強度不能太高（I<0.1mM）。上樣buffer中沒有SDS之外，加入樣品后不能加熱。