反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR),是指以mRNA為模板 在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成的cDNA 第一鏈的PCR。該反應(yīng)分為兩步，第一步在單引物的介導(dǎo)和反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成RNA 的互補(bǔ)鏈cDNA; 第二步加熱后cDNA 與RNA 鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成雙鏈DNA,最后同常規(guī)PCR一樣，擴(kuò)增靶DNA。合成cDNA 第一鏈所用的反轉(zhuǎn)錄酶是一類依賴于RNA 的DNA 聚合酶。目前常用的反轉(zhuǎn)錄酶主要有兩種：一種是來源于禽成髓細(xì)胞性白血病病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，另一種是來源于莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MoMLV) 的MOMLV 反轉(zhuǎn)錄酶。

反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。

中文名

反轉(zhuǎn)錄PCR

外文名

Reverse Transcription PCR，RT-PCR

別名

逆轉(zhuǎn)錄PCR

原理

提取組織或細(xì)胞中的總RNA

性質(zhì)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)廣泛應(yīng)用的變形

概述

RT-PCR反應(yīng)原理

RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。 RT- PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

選擇

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

2． 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。

4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

合成

1． 隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2． Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。

操作

1. 總RNA的提取。

2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：如今試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

（1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。

（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列試劑的混合物：

10×PCR buffer 2μl

25mM MgCl2 2μl

10mM dNTPmix 1μl

0.1M DTT 2μl

輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。

（5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：

第一鏈cDNA 2μl

上游引物（10pM） 2μl

下游引物（10pM） 2μl

dNTP(2mM) 4μl

10×PCR buffer 5μl

Taq 酶（2u/μl） 1μl

（2）加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50μl。輕輕混勻，離心。

（3）設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個循環(huán)。為了保證實(shí)驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對照。

（4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

（5）密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

注意

1． 在實(shí)驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。

2． 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。

3． 內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4． PCR不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗來確定。

5． 防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶處理RNA樣品。

（2）在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。