慢病毒（應(yīng)用于表達(dá)RNAi研究中的病毒）

基本概述

??慢病毒屬是反轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬，包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發(fā)感染的細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，感染個體最終發(fā)病。慢病毒感染的顯著特點(diǎn)是感染個體在出現(xiàn)典型的臨床癥狀之前，大多經(jīng)歷長達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此這些病原體被稱為慢病毒。例如人類免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性貧血(EIA)、貓免疫缺陷病毒(FIV)都是慢病毒屬，慢病毒屬的原文是Lentivirus，其中Lenti-在拉丁文中有慢的意思。

慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將

外源基因有效地整合到宿主染色體

應(yīng)用

慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)

RNAi的

siRNA

短，體外合成siRNA對

的抑制作用通常是短暫

siRNA的載體

由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導(dǎo)RNA合成

慢病毒載體（Lentiviral vector

shRNA

目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加

慢病毒表達(dá)載體，即通常所說的穿梭載體，包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。

特征比較

常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染

細(xì)胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進(jìn)行瞬時感染

慢病毒包裝系統(tǒng)一般由慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝載體組成。

而慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。

慢病毒包裝系統(tǒng)一般都是三質(zhì)粒或四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。其中四質(zhì)粒系統(tǒng)比三質(zhì)粒系統(tǒng)在生物安全性上更好一些，所以應(yīng)用較多。

目的與意義

● 對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi,cDNA 克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個有利的途徑。

● 進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選；

● 為活體動物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；

相關(guān)實(shí)驗(yàn)

1. 根據(jù)目的基因相關(guān)信息（序列，序列號等），構(gòu)建含

有外源基因或siRNA的重組載體

2. 對于測序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；

3. 使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒

液；

4. 濃縮、純化病毒液；

5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞；

6. 通過定量PCR精確測定病毒滴度（高精確滴定方法）和Western 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞；檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進(jìn)

行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，通常狀況下，篩選的細(xì)胞克隆株具有長期的表達(dá)穩(wěn)定

性。病毒液足夠用于一般的動物活體實(shí)驗(yàn)。

操作手冊

1慢病毒使用操作

2慢病毒安全使用規(guī)范

3懸浮細(xì)胞感染方法概要

4相關(guān)專業(yè)術(shù)語（詳情可參考公司網(wǎng)站FAQ)

5細(xì)胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù)

1.慢病毒使用操作手冊

1.1慢病毒的儲存與稀釋：

1.1.1病毒的儲存：用戶收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以將病毒暫

時放置于4 ℃保存；如需長期保存請放置于-80℃（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）

A．病毒可以存放于-80℃ 6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，我們建議在

使用前需要重新滴定病毒滴度

B．反復(fù)凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中

應(yīng)僅盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融我們強(qiáng)烈建議客戶收到病毒后按照每次的使用量

進(jìn)行分裝。

1.1.2病毒的稀釋：用戶需要稀釋病毒時，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細(xì)

胞用PBS或無血清培養(yǎng)基（含血清或含雙抗不影響病毒感染）混勻分裝后4℃保存（請盡量

在三天內(nèi)用完）分裝后使用。

1.2慢病毒用于體外（In Vitro）實(shí)驗(yàn)：感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系

細(xì)胞

1.2.1慢病毒對各種細(xì)胞和組織的親嗜性不同，用戶使用Invabio提供的慢病毒之前可以通過

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對您的目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)（MOI 值）以及在體（In

Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的感染復(fù)數(shù)（MOI 值）（使用24孔板檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性）

1.2.2慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

A．測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時，需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞（HEK293T，Hela）作為平行實(shí)驗(yàn)的對照細(xì)胞。

B．在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時，可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有

血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。

C． Invabio提供的病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：

病毒滴度為>1X10TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X10個具有生物活性的慢病毒顆粒。

1.2.2.2以24孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行目的細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量，如

有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液

第一天，準(zhǔn)備細(xì)胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種3~5X10個目的細(xì)胞，鋪板時

細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 μl；進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為

70%左右。

第二天，準(zhǔn)備病毒：取出4℃保存的病毒，使用臺式離心機(jī)離心20 秒（使病毒完全懸于

離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)

室的實(shí)際情況將按照MOI準(zhǔn)確計(jì)算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有

慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。

第二天，感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，首先觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，

如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實(shí)驗(yàn)，

a使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基

b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細(xì)胞生長良好，密度適宜，則不用換液）

c在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液

d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）孵育過夜

注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞

處于良好的生長狀態(tài)

亦可以將預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中

慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低，通過提高M(jìn)OI 值可以提高病毒的感染效率，但是當(dāng)

MOI高于20時，我們建議客戶在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）來提高病毒的感染

效率。

A．第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在

感染后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài)，可以最

短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換

液后，如果慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。

B．第六天，感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率；

如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通過Real-time

RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)來拍評估感染效率。

注意：

Invabio提供的病毒載體上帶有GFP綠色熒光蛋白，用戶可以在病毒感染96小時后用倒置

熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，以觀察病毒對目的細(xì)胞的感染情況。

如果慢病毒載體攜帶其他Marker Gene如RFP\BFP可以用熒光顯微鏡在對應(yīng)的激發(fā)光波

長下觀察熒光表達(dá)的情況

慢病毒表達(dá)時間較慢，熒光表達(dá)所需時間較長，建議感染后96小時后觀測熒光表達(dá)。感染

后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光的表達(dá)時間和表達(dá)強(qiáng)度來確定慢病毒對目的細(xì)胞

的感染情況。感染期間請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時換液，以保證細(xì)胞良好的生長

狀態(tài)。

2.慢病毒使用安全使用規(guī)范

Invabio提供的慢病毒為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞，也不

會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所

取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)，

Invabio建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認(rèn)某個基

因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。如有疑問，請與我們聯(lián)系。

使用時請參照如下所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：

2.1．病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，

請不要打開排風(fēng)機(jī)。

2.2．病毒操作時請穿實(shí)驗(yàn)服，帶口罩和手套。

2.3．操作病毒時特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒

污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，

離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請于84 消毒液或1%SDS 中浸泡過夜后棄去。

2.4．用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)

板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實(shí)驗(yàn)

臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺。

2.5．如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，

而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。

2.6．脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。

3.懸浮細(xì)胞感染方法概要

1.1根據(jù)細(xì)胞的量將細(xì)胞在1.5ml 管中離心收集然后用100-200ul 的無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞

沉淀，以細(xì)胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準(zhǔn)

1.2按照MOI 換算病毒顆粒數(shù)量，吸取病毒液加入細(xì)胞中，將1.5ml 管放在37℃度培養(yǎng)箱

中孵育30 分鐘

1.3將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里

1.4加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液

1.512 小時后換液

1.696 小時后觀察細(xì)胞陽性率

4.相關(guān)專業(yè)術(shù)語

（詳情可參考公司網(wǎng)站FAQ）

常用術(shù)語：

MOI：病毒感染復(fù)數(shù)傳統(tǒng)的MOI 概念起源于噬菌體感染細(xì)菌的研究。其含義是感染時噬菌體

與細(xì)菌的數(shù)量比值，也就是平均每個細(xì)菌感染噬菌體的數(shù)量。噬菌體的數(shù)量單位為pfu。

一般認(rèn)為MOI 是一個比值，沒有單位，其實(shí)其隱含的單位是pfu number/cell。后來MOI 被

普遍用于病毒感染細(xì)胞的研究中，含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，本手冊中提到的

MOI都是沿用這個概念。

然而，由于病毒的數(shù)量單位有不同的表示方式，從而使MOI 產(chǎn)生了不同的含義。能產(chǎn)生細(xì)

胞裂解效應(yīng)的病毒例如單純皰疹病毒等習(xí)慣上仍用pfu 表示病毒數(shù)量，因此其MOI 的含義

與傳統(tǒng)的概念相同。

MOIstands for "Multiplicity of Infection." It is the ratio of infectiousvirus particles to the number of cells being infected. The recommended MOI isin the range of 0.1 (meaning that you inoculate 1 virus particle for every 10cells) to 0.01. The general theory behind MOI is to introduce one infectiousvirus particle to every host cell that is present in the culture. However,

more than one virus may infect the same cellwhich leaves a percentage of cells uninfected. This

occurrence can be reduced by using a higherMOI to ensure that every cell is infected.

5.細(xì)胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù)

慢病毒載體的包裝與純化

1實(shí)驗(yàn)流程

制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，四種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，感染Hela細(xì)胞后定量PCR檢測病毒滴度。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對慢病毒滴度的要求不同，生產(chǎn)過程中可以通過濃縮得到不同滴度的慢病毒顆粒。

2實(shí)驗(yàn)材料

2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株

慢病毒載體系統(tǒng)（Tronolab）該病毒包裝系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G，目的干擾質(zhì)粒。其中目的干擾質(zhì)粒能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。

細(xì)胞株 293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM（含10% FBS）。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。

菌株；大腸桿菌菌株DH5α。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。

2.2主要試劑

試劑名稱

生產(chǎn)廠家

貨號

包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株

中科院上海細(xì)胞所

大腸桿菌菌株DH5α

Invitrogen公司

胎牛血清

Invitrogen公司

胰蛋白酶

Invitrogen公司

限制性內(nèi)切酶

Fermentas

T4DNA連接酶

NEB公司

M0202V

質(zhì)粒DNA提取試劑盒

Axygen公司

制備感受態(tài)試劑盒

BIOSCIENCES

凝膠回收試劑盒

Qiagen公司

1kb/100bpladder

Fermentas

2.3 ；主要儀器

儀器名稱

生產(chǎn)廠家

貨號

PCR儀

Applied Biosystems公司

電泳儀

Bio-rad公司

熒光倒置顯微鏡

奧林帕斯

冷凍超速離心機(jī)

Hitachi

細(xì)胞培養(yǎng)箱

healforce

凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀

Tianneng

恒溫?fù)u床

上海博訊儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱

上海博訊儀器

移液器

eppendorf

電熱恒溫水浴鍋

上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

數(shù)碼凝膠處理系統(tǒng)

天能科學(xué)儀器

一次性平皿

Cell-star

燒瓶

3慢病毒載體系統(tǒng)質(zhì)粒基本信息和圖譜

該病毒包裝系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G，目的穿梭質(zhì)粒。其中穿梭質(zhì)粒（目的穿梭質(zhì)粒）含有能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）；pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包裝所必須的元件。

3.1穿梭質(zhì)粒：目的穿梭質(zhì)粒

3.2pRsv-REV

3.3pMDlg-pRRE

3.4pMD2G

4慢病毒生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)步驟

4.1慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293 T細(xì)胞，細(xì)胞密度為0.5×10時；重新接種于25 mL的15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

4.2制備慢病毒包裝系統(tǒng)中四種質(zhì)粒DNA溶液；

pRsv-REV 10 μg，

pMDlg-pRRE 15 μg，

pMD2G 7.5 μg,

干擾質(zhì)粒 20 ug

加入無菌水定容至1800 μL，再加入CaCl2 （2.5 mol/L) 溶液200 μL，混勻，加入2×BBS緩沖鹽溶液2000 μL，室溫放置20～30 min；

4.3 ；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時轉(zhuǎn)染. 將DNA和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)12 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入PBS 15 mL，輕搖后棄去，重復(fù)該步驟3次.；

4.4每瓶細(xì)胞中加入含100 mL/L小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液15 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.；

4.5收集轉(zhuǎn)染72 h的293T細(xì)胞上清液；

4.6將收集的上清液于4℃，4000 g離心10 min，收集上清液；

4.7將各種不同RNA干擾質(zhì)粒上清液以0.45 μm濾器過濾；

4.8于40 mL超速離心管中，4℃，25000 r/min離心20 min；

4.9而后以冰PBS液，分別溶于500ul Dmem，和500ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解過夜