原核表達(dá)載體，能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的載體。

定義

能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的載體

載體調(diào)控原件

啟動子

原核表達(dá)載體

啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少 的重要調(diào)控序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子。原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點上游5～10 bp處，有一段由6～8個堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10區(qū)。來源不同的啟動子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈。原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子) 、lPL (l噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。SD序列

1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個完整的蛋白質(zhì)。

終止子

在一個基因的3￠末端或是一個操縱子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號上，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜，并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。

表達(dá)載體構(gòu)建

獲得目的基因

（1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

（2）通過RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

構(gòu)建重組表達(dá)載體

（1）載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

（1）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

（2）測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

原核表達(dá)載體

（3）以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。