組織固定（組織固定）

定義

在組織病理學(xué)中，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標(biāo)本的保存，都必須進(jìn)行及時的適當(dāng)?shù)暮陀行У墓潭?。組織只有經(jīng)過固定，才能完成隨后的一系列的制作，直至切片的最后完成。每個醫(yī)務(wù)工作人員都能容易地把組織固定起來，但是，要清楚了解固定的過程及其定義是一件十分不易的事。

作用

組織經(jīng)一系列的處理后，就必須進(jìn)行固定，當(dāng)然有的組織是先固定，再進(jìn)行處理，然后再固定。固定的作用，從組織學(xué)的角度其簡單的定義是，保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使之盡量保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而從免疫組化技術(shù)的角度，固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)；以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；更重要的是保持組織或細(xì)胞的抗原性，不但要使抗原不導(dǎo)致失活，而且不使抗原發(fā)生彌散的現(xiàn)象，才能在免疫組化染色時，不產(chǎn)生過深的背景，影響對陽性物的判斷。

目的

1、能防止細(xì)菌的腐蝕和組織的自溶。細(xì)菌無處不存在，它們隨時都可污染腐蝕未經(jīng)處理的組織。固定液可以固定任何蛋白質(zhì)，凡有生命的東西，都由蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)被固定，生命就停止，細(xì)菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人們?？膳龅竭@樣的問題，一塊肉不經(jīng)處理放了幾天后就會變質(zhì)，這是為什么呢？除了細(xì)菌參與外，其本身也是很重要的。因為組織離體后，供應(yīng)這此組織的血液隨之消失，細(xì)胞缺氧，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，破壞后釋放出溶酶體酶，日常生活中常碰到的肉變質(zhì)，就是細(xì)菌污染加組織自溶的結(jié)果。

2、保存細(xì)胞固有的物質(zhì)，能凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液，糖原等，使細(xì)胞或組織基本上保持與生活時的物質(zhì)一樣。細(xì)胞的固有物質(zhì)，即細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基器、溶酶體、過氧體，細(xì)胞骨架，組織液，抗原、糖元等。這些物質(zhì)，如果不將其及時固定，是很容易喪失的，尤其是溶酶體，很容易受到破壞，因此應(yīng)特別小心。

3、使組織硬化，便于切塊。剛離體的組織，除了胃組織以外，都是柔軟的組織，尤其是胃腸道的組織，如果在沒有固定時就取材，效果就很差，不是取材不規(guī)整，就是厚薄不均，粘膜和肌層很容易分開，因此，要取得規(guī)整標(biāo)致的材料，就必須將組織徹底固定，再行取材。

4、對某些具有傳染性的標(biāo)本，能防止疾病的擴(kuò)散。病理標(biāo)本、種類繁多，成份復(fù)雜，各種病例都有，具有傳染性的病種也不少，如結(jié)核、肝炎、麻風(fēng)、性病等等。對于此類標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)行徹底的固定后，再行取材，如結(jié)核球，固定時間應(yīng)在3-5天。

5、保存好大體標(biāo)本。對于有教學(xué)任務(wù)的醫(yī)院病理科，除搞好疾病的診斷外，還有收集有價值的大體標(biāo)本，有些大體標(biāo)本，是很難得到的。因此要求在平時就要留心觀察，小心處理。遇到有教學(xué)價值的罕見的典型的標(biāo)本，就必須及時固定，認(rèn)真給予對待。

6、可增強(qiáng)染色的作用。組織經(jīng)過及時的固定，最終可見到切片有鮮艷的染色，而如果有一批未經(jīng)及時固定的組織，將看到最終的結(jié)果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得結(jié)論，固定可以增強(qiáng)染色的作用。

注意事項

1、組織固定越新鮮越好。組織一經(jīng)離體，就能及時地固定，這是最好的。根據(jù)實驗，如果要獲得某些酶的染色，固定最好在組織離體后30秒至1分鐘。對于其它達(dá)不到些要求是越快越好。

2、組織固定，組織塊不宜過大。凡是需要固定的組織，都不應(yīng)該太大太厚，這是因為所有的固定液穿透力不夠強(qiáng)，浸透度不夠快的緣故。如果較大厚的組織，不經(jīng)處理就進(jìn)行固定，那么待固定液進(jìn)入至中間對可能這些組織早就發(fā)生自溶了。因此，對于較大的組織，必須先進(jìn)行處理，切成制片材料再行固定，這是最佳的處理方法，如遇到胃腸的器官，則應(yīng)將其剪開，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因這類組織、粘膜和肌層容易分開，沒固定時，難以取得最佳制片材料，對于產(chǎn)酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

3、對不同類型的組織應(yīng)適當(dāng)合理地選擇固定液。有的固定液對于組織有膨脹作用。固定劑是一種化學(xué)試劑，有液體和固體之分，一般使用較多的是液體，而固體固定劑如多聚甲醛，則多用于實驗研究的組織固定。固定劑的種類繁多，成份復(fù)雜，對組織的作用不盡相同，英國著名的組織化學(xué)專家Pearse指出：對于每個既定的組織化學(xué)方法來說，選擇最合適的方法是極為重要：在組織化學(xué)研究準(zhǔn)備階段不論采用什么固定劑，都必須盡可能確切地知道它們對于各種組織成分的反應(yīng)基團(tuán)的效用。Jones（1973），指出理想的固定劑必須具備的條件是，防止?jié)B透損傷和收縮，以達(dá)到在各級可見度的水平皆無形態(tài)變化；要求組織所有的成分能保留于原位。他認(rèn)為有三種試劑即甲醛、戊二醛和丙稀醛接近于達(dá)到上述要求。為了更好地把組織中各種成分盡量保存好，盡量好給予顯示出來，就決不能千篇一律地使用一種固定液，而必須認(rèn)真地深入研究各種固定液的性能和使用方法。例如：丙酮，它對組織有明顯的皺縮，硬化作用，平常它是決不會被用來作固定液的，用它不但太浪費，造價太高，而且也使切片較為困難，但是，對于某些酶的研究，狂犬病腦組織的固定，某些細(xì)胞的培養(yǎng)等。最好的固定液還是丙酮。因為如果使用福爾馬林固定液、石蠟切片顯示酸堿磷酸酶就顯示不好，狂犬病病毒的包函體就會消失掉，又如醋酸，它對膠原纖維等有膨脹的作用。由于各種固定液對不同的組織有不同的作用，因此許多專家將根據(jù)各種固定液的優(yōu)缺點，配制出許多混合液的方法來，給組織的良好固定起到了非常積極的作用。但是，值得指出的是并非所有的固定液都不是十全十美的，例如，酒精、甲醛、醋酸固定液，對組織固定很好，組織中各物質(zhì)的染色也十分清晰，但對固定脫水盒為銅質(zhì)的組織時，效果就不好，原因是醋酸跟酮可發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生醋酸銅，沉淀于組織中，可造成對抗原的損害，對于免疫組織化學(xué)的顯示，經(jīng)實驗證明：可呈弱陽性乃至陰性。由此可見，固定液的選擇正確與否決定著對某些病例的免疫組化標(biāo)記的成敗關(guān)鍵。在我們的日常工作科研中，對于組織的固定，應(yīng)有針對性的選擇，方能獲得滿意的效果。

4、組織固定，時間不宜太短，也不宜太長。時間太短，就不能很多的固定組織，因為不管組織大小，固定液浸入組織之中，都需要有一定的時間，時間太短，就會影響組織固定的效果，對以后一系列關(guān)系的處理都有影響，切片質(zhì)量難以保證，固定時間太長，也不好。組織長時間的固定，福爾馬林會產(chǎn)生一種酸，影響核的染色。對于固定很長時間的陳列性標(biāo)本制片后切片染色不鮮艷，顯得非常陳舊。另外，長時間的固定往往會出現(xiàn)福爾馬林色素，尤其是造血器官的標(biāo)本，更應(yīng)注意。固定時間過長，可降低抗原的活性。

5、固定液的量要充分。固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗，有的人認(rèn)為，固定液的量與組織的比應(yīng)是20：1，這個要求對于小組織來說是完全可以達(dá)到的，但對于大標(biāo)本來說，則是一件非常困難的事情。因為對于大醫(yī)院來說，每天都有幾十上百例的標(biāo)本，小如大頭針大小，大的達(dá)幾十斤的腫瘤，對于這樣大的標(biāo)本，按20：1的比例來做，顯然是不可能的事，既要做到組織能固定好，又不使組織吹干就必須具體情況具體處理。對于大的標(biāo)本，原則上是不讓其暴露部分被吹干，這是因為在現(xiàn)實當(dāng)中，大的標(biāo)本往往露出容器一大半，因此對于這種情況，應(yīng)取些脫脂棉或紗布，浸濕固定液后，蓋于組織表面，以免使組織被風(fēng)干，影響制片效果。

6、特殊病例或特殊物質(zhì)應(yīng)選擇特殊的固定液。一般的病例標(biāo)本，如沒特殊的要求，都可以應(yīng)用甲醛配成的各種固定液來固定。但是，如果要顯示狂犬病毒的包含體時，應(yīng)用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定，顯示糖元，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。固定劑是一種化學(xué)語試劑，有液體和固體及之分，平常使用的多為液體，Pearse指出，對每個既定的組織化學(xué)方法來說，選用最合適的固定方法是極為重要的；在組織化學(xué)研究中的準(zhǔn)備階段，不論采用什么固定劑，都必須盡可能確切地知道它們對于各種組織成分反應(yīng)基團(tuán)的效用。

7、組織的第二次固定或后固定。在一般的常規(guī)病理活檢組織中，往往用一種固定液，就能夠達(dá)到目的，獲得滿意的結(jié)果。但是，對于某些特殊病例光用一種固定液是不夠的，必須根據(jù)不同的情況，使用特殊的固定液再次將組織固定，或者在切片后染色前再行固定。這種方法稱為二次固定或后固定。例如：胚胎性橫紋肌肉瘤，由于腫瘤細(xì)胞發(fā)育較幼稚，完全不象成熟的橫紋肌組織所固有的橫紋，在進(jìn)行特殊染色前，就必須用Zenker氏固定液進(jìn)行第二次固定，方能較好地顯示出橫紋肌纖維來。否則，效果不佳。另外，電鏡固定的標(biāo)本，通常都需要后固定。其使用方法是先用戊二醛固定，再用奧酸固定。

規(guī)范

1、病理標(biāo)本從采集到固定應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成（越早固定越好，記錄精確到分鐘），并記錄標(biāo)本離體時間（精確到分鐘）。

2、送檢的病理標(biāo)本需用標(biāo)準(zhǔn)病理標(biāo)本袋盛放。

3、組織標(biāo)本常規(guī)固定液為10%中性福爾馬林溶液（即甲醛原液與水按1：9的比例配置），手術(shù)室及手術(shù)科室標(biāo)本應(yīng)使用同樣濃度的固定液。

4、固定液量應(yīng)為被固定標(biāo)本體積的5～10倍。

5、一般標(biāo)本的固定時間為12～24小時，特殊組織須延長固定時間。

6、快速冰凍標(biāo)本立即送檢，不要加任何固定液。

使用

當(dāng)前，應(yīng)用于固定試劑的種類較多，它們對于固定不同的組織成分起著不同的作用，因此我們在使用時應(yīng)該了解不同固定劑的效能，才能合理的固定組織。根據(jù)Bencroft的分類法，將不同的固定劑分為四種類型：

Ⅰ類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。

Ⅱ類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。

Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。

Ⅳ類：其他，氯化汞，苦味酸等。

上述四種類型的固定劑，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到。下面根據(jù)使用的需要，將著重介紹幾種常用的固定劑。

（1）甲醛

甲醛商品名為福爾馬林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛氣體飽和于水而成，比重為1.12。它也可以穩(wěn)定的固體形式存在，它的成分為高分子量的聚合體，稱為多聚甲醛。

甲醛溶液較難純化，在每批市售商品中，都含有不少的雜質(zhì)如甲醇，這種在組織化學(xué)方法當(dāng)中，能使酶鈍化，影響其反應(yīng)。甲酸，它可使固定液變酸，在陳列標(biāo)本或長時間固定的組織，由于酸的作用，往往細(xì)胞核染色欠佳。

甲醛有效固定作用的要點是，在蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈。參與甲醛固定蛋白質(zhì)的基團(tuán)，主要為氨基，亞氨基及酰氨基，肽，胍基，羥基，SH和芳香環(huán)。甲醛與組織蛋白類的反應(yīng)是多樣和復(fù)雜的，因為它能和多種不同的功能基團(tuán)結(jié)合，在多數(shù)情況下在其間形成橋鍵。甲醛有這種交聯(lián)的功能，也是它的缺點，在用甲醛固定過的組織中，需要做免疫組化的，往往提倡用酶消化或熱抗原修復(fù)法來使蛋白與甲醛交聯(lián)的醛鍵斷裂開，以利于后來的染色。

甲醛可配成簡單的或混合的固定液，最簡單和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，這就是10%的福爾馬林。當(dāng)然，現(xiàn)在使用的固定液要求較為嚴(yán)格些，最好是使用緩沖福爾馬林固定液，這將有利于后來的免疫組化染色的需要。

從組織學(xué)的觀點來說，甲醛是一種良好的固定劑，它有很多的優(yōu)點:

1.組織收縮較少，損傷少，保存固有物質(zhì)好.

2.固定均勻，穿透力強(qiáng).

3.能使組織硬化，增進(jìn)組織彈性，有利于切片.

4.能保存脂肪及脂類物質(zhì).

5.成本較低.

雖然甲醛有上述的優(yōu)點，但這都是相對而言，任何物質(zhì)都不可能十全十美的，它也有許多缺點:

1.雜質(zhì)含量較多，如甲醇，可鈍化酶類，影響反應(yīng).

2.含有微量甲酸，導(dǎo)致固定液酸變，影響染色.

3.可產(chǎn)生福爾馬林色素，影響觀察.

4.不能固定尿酸和糖類物質(zhì).

5.容易揮發(fā)，污染環(huán)境，可導(dǎo)致標(biāo)本干涸.

6.可長期存在于固定過的組織上。有人做過實驗，組織用甲醛固定后在流水中沖洗5小時后，仍留有相當(dāng)多的甲醛與蛋白質(zhì)相結(jié)合，但需要經(jīng)過長時間的流水沖洗(24天的沖洗)方能除去。可見存在于組織上的甲醛是不可能除去的。因為臨床活檢不可能有這么長的時間來沖洗組織。因此要特別指出的是，在其后的各種技術(shù)操作中，要特別注意到甲醛的存在，必須要想辦法除去它，否則將會給各種染色造成影響，甚至導(dǎo)致失敗。

應(yīng)用甲醛，可以配成許多種固定液:

1.10%緩沖福爾馬林固定液

甲醛100ml

蒸餾水900ml

NaH2PO44g

Na2HPO46.5g

該固定液是當(dāng)今流行的固定液，因它對組織固定較好，損傷較少，因?qū)ζ浜蟮母鞣矫娴难芯慷驾^好，尤其是對免疫組化的染色.

2、10%福爾馬林固定液

甲醛100ml

自來水900ml

這是一種最簡單的固定液，適合于邊遠(yuǎn)地區(qū)攜帶的固定液，但由于它的單一性，因此，只要有條件的單位都不要求使用這種固定液。

3、10%福爾馬林鹽固定液

甲醛100ml

自來水900ml

Nacl9克

先將Nacl溶于水，再加入甲醛。這也是一種較為簡單的固定液，但由于加入Nacl，它是一種重金屬鹽物質(zhì)，加入了它可促進(jìn)和改善染色，增加染色的強(qiáng)度。

4、Bouin氏固定液

苦味酸飽和水溶液75ml

甲醛2ml

冰醋酸5ml

該固定液中的冰醋酸，對膠原纖維等組織有膨脹作用。而甲醛對組織有收縮作用。兩種試劑的混合使用，用以抵消彼此間的副作用。使組織固定達(dá)到優(yōu)良的固定水平。

5．醛糖鈣固定液

甲醛100ml

蔗糖300ml

乙酸鈣20g

蒸鎦水90ml

先將蔗糖和乙酸鈣溶于蒸鎦水，后加入甲醛。該固定液對于做酶的組織化學(xué)的研究效果較好，組織固定后，做冰凍切片，再給予顯示。

當(dāng)前國內(nèi)外基本上都還是要用甲醛來固定組織。從免疫組織化學(xué)的角度來說，甲醛固定的組織大部分都可以用免疫組化的手段來檢測，據(jù)多人認(rèn)為，它對IgA，IgM，J鏈，K鏈和λ鏈的標(biāo)記效果較好，且背景清晰。但美中不足的是：經(jīng)它固定的組織，可與蛋白形成醛交聯(lián)蛋白，這種醛鍵可封閉抗原。固此，在免疫組化實際檢測中，應(yīng)根據(jù)不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修復(fù)如微波、高壓等的方法，以便破壞醛鍵重新暴露抗原。

（2）酒精：又稱乙醇，為無色透明的液體，沸點是78度，工業(yè)酒精是95%。

酒精它有許多優(yōu)點：

1、可保存尿酸結(jié)晶和糖原等物質(zhì)。高濃度的酒精如95%，無水酒精可保存上述兩種物質(zhì)，因它們易溶于水，因此，要證明上述兩種物質(zhì)的存在，就不能用含水的固定液來固定組織。

2、能在任何比例的情況下與水混合，在病理技術(shù)中，酒精是一種十分重要的試劑，它起著關(guān)鍵的作用。如果沒有酒精，將會無法完成必要的工作。如組織的脫水，切片染色前后都離不開酒精，在常規(guī)的工作中，通常都用95%的工業(yè)酒精來配成60%、70%、80%、90%等不同的濃度來使用。

3、可溶解苯類物質(zhì)為染色步驟中的橋梁試劑。常規(guī)活檢等切片上的石蠟必須除去，才能進(jìn)行染色，能除去石蠟的物質(zhì)有苯及汽油等，常用的有苯類試劑，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在這里充擔(dān)著除去苯和連接水的作用，為切片入水架起了橋梁，因此稱它為橋梁試劑。

4、能除去切片上的水份，使切片無水化。切片經(jīng)染色后，由于所用的試劑都為水溶液，因此在切片上含有大量的水份，這些水份經(jīng)系列梯度酒精的置換吸附后，到無水酒精中已完全無水，這樣處理對于切片的保存是有好處的，否則，切片將會褪色。

5、可用來保存標(biāo)本。大體標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定后，如為了陳列保存，必須取出沖冼。然后移入75%的酒精中。如果用福爾馬林作陳列標(biāo)本的固定液，則因為福爾馬林含有雜質(zhì)較多，液體容易酸化，時間一長，會逐漸變?yōu)槲ⅫS*色或淡黃*色，影響美觀，影響陳列的效果。

6、可與其它試劑配成多種的混合固定液，有時為了加快固定，常采用酒精和其它試劑來配成混合固定液，這種固定液在固定的同時，兼有對組織脫水的作用。應(yīng)用酒精配成的混合固定液有：

①Carnoy氏固定液

氯仿300ml

冰醋酸100ml

95%酒精600ml

該固定液固定組織快速，在固定的同時兼有脫水的作用。溶液中的氯仿和酒精，對組織的收縮較厲害，但應(yīng)用了冰醋酸，這種現(xiàn)象便被中和去。

②AF固定液

甲醛100ml

冰醋酸50ml

95%酒精850ml

這種固定液的作用與上液有相似之處，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脫水用具不能使用銅制的脫水盒，因冰醋酸跟銅離子起反應(yīng)，生成醋酸銅，這種物質(zhì)可沉淀于組織間，可破壞組織中的抗原，造成免疫組化檢測的失敗。應(yīng)用時應(yīng)多加注意。

酒精也有許多不足之處，它的缺點是：

1、可溶解脂類物質(zhì)，凡要證明組織是否含有脂類和類脂物時，切不能用含有酒精的固定液去固定組織，也不能用石蠟切片，因為酒精可將它們?nèi)芙馊ィ炃衅M織中含有的脂類物質(zhì)，則在組織脫水時被溶解去，只留下脂類或類脂物所占有的空間。

2、對組織收縮較大，不宜作單純固定液。高濃度的酒精，對組織有顯著的收縮作用，造成組織發(fā)硬易脆，難以切片等現(xiàn)象。因此，它不作為單純的固定液。

3、滲透力不強(qiáng)。當(dāng)用酒精固定組織時，組織表面很快就被固定，并形成了一層蛋白膜，這層膜可阻擋固定液向里滲透，造成了中間組織固定不佳的現(xiàn)象。

4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡經(jīng)酒精固定的組織，核的染色都不好。

5、可脫去切片上已著染的各種顏色，切片經(jīng)染色后，一是必須洗去多余的染液，二是必須脫去切片上的水。在用酒精洗切片時，必須仔細(xì)地掌握顯微鏡下觀察，還要掌握酒精的濃度，低濃底的酒精脫色力強(qiáng)，稍不注意，便可脫去切片上大部分的顏色。切片脫水時，要較快地通過低濃度的酒精，以免使已著染的顏色被脫去。

6、價格較貴。從經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度，應(yīng)用酒精固定組織劃不來，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例標(biāo)本需要100ml計，可固定50例標(biāo)本，而一瓶500ml的酒精，即使配成80%酒精，也只能固定6例標(biāo)本，因此，若用酒精固定組織，其價格比用甲醛固定組織的要高8倍。

（3）冰醋酸。冰醋酸為無色透明的液體，易揮發(fā)，氣味大，一打開瓶蓋，整個文章都可聞其味道，純醋酸在17℃時常為結(jié)晶狀，因稱為冰醋酸，在冬天使用時，可用微波爐進(jìn)行解凍，再行使用，它的優(yōu)點有：

1、能迅速固定染色質(zhì)，助于染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均勻，對于染色質(zhì)的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明礬蘇木素和伊紅時，常常需加入一定量的醋酸，以促進(jìn)染色。

2、能使組織尤其是富含纖維的組織膨脹。

各種固定液對組織都有收縮的作用，尤其是對富含纖維的組織。而它不但不會使組織收縮，而且還會令許多組織發(fā)生膨脹的作用。根據(jù)這個特點，用它配成許多種不同的混合固定液，以達(dá)到固定好，收縮少，易切片，效果好等目的。用它配成的混合固定液有：

（1）Zenker氏固定液：

重鉻酸鉀25G

升汞50G

蒸餾水1000ml

冰醋酸50ml

先將重鉻酸鉀和升汞溶于水中，尢其是重鉻酸鉀，應(yīng)用熱水或加溫的方法將其溶解，然后過濾貯存于帶蓋的玻璃瓶中，如暴露于空氣中，該溶液將會被慢慢氧化而便顏色加深，導(dǎo)致失效。臨用時，取貯存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。

應(yīng)用該固定液固定的組織，一般不要超過24h，取出組織，流水沖冼12小時以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必須用碘除去汞鹽的沉著。應(yīng)用該固定液的組織，細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色十分清晰，特別是要顯示骨骼肌的橫紋時，應(yīng)用本液可獲得滿意的結(jié)果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存細(xì)胞顆粒，紅細(xì)胞及含鐵血黃素。

（2）Flemming氏液

2%酸水溶液200ml

1%鉻酸水溶液700ml

冰醋酸100ml

該液中的奧酸對脂肪組織既有固定作用，又有染色作用，對有髓神經(jīng)纖維也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色，該液不適合。應(yīng)用該液固定的組織，切片不能太大過厚，一般1-2毫米厚固定時間1-3天，后經(jīng)水洗，保存于80%酒精中，除上述兩液體外，還有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有許多不足之處：

1、不能作為單一的固定劑。冰醋酸在實際應(yīng)用中，常被作為添加劑來使用，如許多種固定液，都加入了冰醋酸。另外，在蘇木素和伊紅染液中，也常加入了冰醋酸。

2、不能凝固蛋白質(zhì)，不能保存白細(xì)胞顆粒，紅細(xì)胞及含血鐵黃素等。

3、價格較貴。

(4)重鉻酸鉀是一種固體，粉末狀，桔紅色，具有毒性，較難溶解于涼水，因此在配制時用較高溫度的水來溶解，也較易發(fā)生沉淀。它的優(yōu)點是：

1、能固定脂肪及類脂物。

2、為髓鞘及嗜鉻細(xì)胞優(yōu)良的媒染劑。

3、可配成多種的混合固定液

（1）Helly氏液

重鉻酸鉀25g

升汞50g

蒸餾水1000ml

甲醛50ml

臨用時加入甲醛，因其加入后于24小時后可發(fā)生沉淀而失效，因用時應(yīng)特別注意。該液是白細(xì)胞顆粒的優(yōu)良固定劑，因此凡為白細(xì)胞或造血器官如骨髓，脾臟及患先天性梅毒之肝臟等，可用此液固定。此液原配方要求加入硫酸鈉，但據(jù)我們經(jīng)驗認(rèn)為，硫酸鈉在液中對組織無任何作用，故省去。

（2）Orth氏液

重鉻酸鉀20g

蒸餾水1000ml

甲醛100ml

該液固定組織較緩慢，不適合于作臨床的活檢固定液，4毫米厚的組織固定時間需36-72小時，該液對于染色質(zhì)的固定好，顯示清晰，但可溶解部分紅細(xì)胞和含鐵血黃素。

重鉻酸鉀的不足之處有：

1、不能沉淀蛋白質(zhì)，它必須和醋酸配成混合固定液，方能發(fā)揮作用，產(chǎn)生鉻酸，沉淀蛋白質(zhì)。

2、具有毒性及產(chǎn)生高溫。在配制液體時，如清洗劑，當(dāng)加入硫酸時，可產(chǎn)生很高的溫度，并揮發(fā)出刺鼻的氣體，應(yīng)特別注意。

3、它不能長期固定組織，經(jīng)它固定的組織應(yīng)充分水洗后保存于80%酒精中。

（六）氯化汞又稱升汞，具有毒性。單獨用于固定組織，對組織有較大的收縮力，故很少單獨使用。它可使組織蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，這是由于它穿透力極弱所致，因此它不適合固定較厚的組織。它常與其它的試劑配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足，使固定組織的效果非常好。應(yīng)用升汞配成的固定液的優(yōu)點有：

1、細(xì)胞核及細(xì)胞漿染色清晰。

2、對白細(xì)胞顆粒，造血器官如骨髓和脾臟等是優(yōu)良的固定劑。

3、可配成許多混合固定液如：Zenker氏、Helly氏和Stieve氏等。

它的不足之處是：

1、容易產(chǎn)生汞鹽沉淀。經(jīng)升汞配成的混合固定液固定的組織，一是不能固定太長時間，經(jīng)24h后沖水，然后保存于70%或80%的酒精中，二是在洗色前，都必須用碘除去汞鹽的沉淀，以免由于汞鹽沉淀在切片上而影響對切片的觀察。

2、對組織有較大的收縮力且穿透力弱，用它不能固定過厚的組織，因穿透力弱，組織中間部分固定不好。

3、具有毒性。

微波輻射

組織固定的結(jié)果是組織中的蛋白質(zhì)凝固，以保存組織中原有的微細(xì)結(jié)構(gòu)。常規(guī)固定用的是甲醛或酒精等。但是這些固定劑從某些方面來說其穿透力不很強(qiáng)，因而需要較長時間的固定，另者，臨床上的冰凍切片，有的應(yīng)用快速加熱法預(yù)先固定組織，造成福爾馬林的極度揮發(fā)，污染環(huán)境，影響人們的身體健康，因此尋找其它固定組織的方法就成為研究的重點。微波輻射固定組織，就是在這種情況下產(chǎn)生的。

微波是一種具有能量的電磁波，在其運動期間可產(chǎn)生瞬間熱。由于微波的快速運動，也導(dǎo)致了物體內(nèi)部極性分子的快速運動，產(chǎn)生了熱量，致使組織蛋白凝固，因此，舊的叫法稱微輻射固定組織。按實際的應(yīng)稱為微波輻射凝固蛋白。

1、組織固定溫度和時間的選擇。

究竟微波產(chǎn)生的熱量需要多高，才級使蛋白凝固的呢：Masson氏等人的研究表明，700-90℃，對沒有固定的蛋白可發(fā)生變性。Bernard經(jīng)過一系列的研究后認(rèn)為，肝、腎、肺的最佳固定溫度是70℃，和77℃，因為各種組織的結(jié)構(gòu)不同，成分不一，電子密度不一樣，因而固定所需要的溫度也不樣。我們的實驗認(rèn)為，65℃左右的溫度可適合于各種組織，條件是固定取小塊材料，時間在截取3-4min。

2、微波爐檔次的選擇

目前市售微波爐品種繁多，要選用合適的微波爐，必須根據(jù)各人的使用習(xí)慣和愛好。微波爐一般分為高火、中火及低火。使用時要進(jìn)行系列實驗。例如多少ml的固定液需要多少時間達(dá)到多少溫度，用的是哪一檔次的火等。

3、微波輻射需固定液的選擇

張素娟等應(yīng)用臨床活檢新鮮組織如：甲狀腺、乳腺和淋巴結(jié)，實驗小鼠的腫瘤、肝臟、腎臟、心和肺等組織，分別用10%的福爾馬林和生理鹽水經(jīng)微波輻射后，通過HE、網(wǎng)染、AB-PAS以及幾種抗體如CEA、EMA和L26等的檢測后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水的結(jié)果最好。

一提固定，以往總與福爾馬林分不開，而經(jīng)微波輻射后的固定效果，竟然比前者好，這就解決了一大難題，即快速石蠟切片及冰凍切片的組織固定，以往用加熱固定的方法，其結(jié)果導(dǎo)致福爾馬林蒸發(fā)，使整個房間都充滿福爾馬林氣味，既污染了環(huán)境，也影響了身體的健康。雖然生理鹽水用微波輻射后對組織有良好的固定效果，但是它只能適合于少量的快速制片和某些研究，絕不可能適合于大批量的活檢。因為活檢取材，現(xiàn)目前組織的制作，都基本上用機(jī)器來進(jìn)行，而所用的脫水盒，有銅和不銹剛的金屬物所制成，組織取材后，一個一個的盒子裝著組織，如果除去金屬來用微波固定，這是不現(xiàn)實的事情。另外，微波輻射，它的穿透力較弱，大量的組織塊，其中間是達(dá)不到要求的。