雜交瘤技術(shù)的基本原理
一單克隆抗體的制備
1975年kǒhler和milstein首先報(bào)道用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（srbc)免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立起第一個(gè)b細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，并成功地制得抗srbc的單克隆抗體（monlclonalantibody,MCAB）。迄今世界已研制成數(shù)以千計(jì)的mcab。
單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易，所以一問世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，mcab在診斷疾病、判斷預(yù)后、防治疾病以及疾病機(jī)制研究等方面起著巨大的促進(jìn)作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理
雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細(xì)胞作小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（選擇原理后見），小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。其原理從下列幾個(gè)主要步驟闡明。
（一）細(xì)胞的選擇與融合
建立雜交瘤技術(shù)的是制備對(duì)抗原特異的單克隆抗體，所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的b細(xì)胞，通常來源于免疫動(dòng)物的碑細(xì)胞。脾是b細(xì)胞聚集的重要場(chǎng)所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會(huì)出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增殖，只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是b細(xì)胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細(xì)胞融合伴侶。目前常用的b細(xì)胞瘤株有：p3-x63-ag8(kǒhlerandmilstein，1975)，p3-nsi/1-ag4-1(kǒhlerandmilstein，1976)，x63-ag8.563(kearneyetal，1979)，sp2/0-ag14(schulmanetal，1978)等，這些細(xì)胞株皆為hat敏感細(xì)胞株。
使用細(xì)胞融合劑造成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（peg1000～2000）是目前最常用的細(xì)胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40％（w/v）。
（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用
細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸中，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。
細(xì)胞dna合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成dna，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hgprt）和胸腺嘧啶核苷激酶（tk）的催化作用合成dna。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，h）、氨甲蝶呤（aminopterin，a）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，t），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成dna，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的hgprt－細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在hat培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖（圖11-1）。
（三）有限稀釋與抗原特異性選擇
在動(dòng)物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。
一種抗原往往有多個(gè)決定簇，一個(gè)動(dòng)物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實(shí)質(zhì)是眾多b細(xì)胞群的抗體分泌。而針對(duì)目標(biāo)抗原表位的b細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中，有相當(dāng)比例的無關(guān)細(xì)胞的融合體，需細(xì)篩選去除。
篩選過程一般分為兩步進(jìn)行：一是融合細(xì)胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體篩選。將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30％的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清以elisa法選出抗體高分泌性的細(xì)胞；這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的elisa找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)。
