慢病毒載體（慢病毒載體）

概念

慢病毒載體

輔助成分

慢病毒載體輔助成分包括：慢病毒包裝質(zhì)粒和可產(chǎn)生病毒顆粒的細(xì)胞系。

慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。

基本原理

慢病毒包裝流程

由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個質(zhì)粒上，一個質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如人腎293T細(xì)胞)，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。

為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動子、3′LTR換成SV40 polyA等。

改進(jìn)

采用表達(dá)水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質(zhì)粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質(zhì)粒，分別取代表達(dá)HIV本身包膜蛋白Env的質(zhì)粒，使HIV-1載體顆粒包上了VSV或雙嗜性MLV的 包膜。這樣做的結(jié)果至少具有三個方面的積極意義：①包膜的更換進(jìn)一步降低了慢病毒載體恢復(fù)成野生型病毒的可能；②使HIV載體感染宿主的范圍不再僅限于CD4+細(xì)胞，而擴(kuò)大到幾乎能感染所有組織來源的細(xì)胞；③VSV的包膜賦予慢病毒載體顆粒高度的穩(wěn)定性，使其能夠通過超速離心而濃縮，達(dá)到高滴度。Naldini等已使慢病毒載體滴度由105轉(zhuǎn)錄單位(TU)/ml達(dá)到108TU/ml。

包裝成分的構(gòu)建應(yīng)在不重組病毒的裝配和感染力的前提下，盡可能地減少無關(guān)的HIV-1蛋白的表達(dá)，為野生型病毒的恢復(fù)設(shè)置障礙。Naldini等在構(gòu)建包裝質(zhì)粒時，阻止env基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，Zufferey等將包裝包裝質(zhì)粒上表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4個基因分別刪除或聯(lián)合刪除。這4個調(diào)節(jié)蛋白或已被證實(shí)、或被高度懷疑是構(gòu)成HIV毒性的因素，將其刪除、加上包膜蛋白的替換，可使制備HIV載體過程中產(chǎn)生野生型病毒的可能必微乎其微。

載體質(zhì)粒上HIV-1的順式序列通常包括兩端的LTR、剪切位點(diǎn)及包裝信號Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高載體RNA的包裝效率；Rev蛋白需要與Rev反應(yīng)元件(RRE)相作用，將未剪切的載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿。因此，Naldini等在載體上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了產(chǎn)生載體顆粒的能力。^[1]

應(yīng)用前景

對于AIDS的基因治 療方案，基本上是以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的方式，將抗病毒基因體外導(dǎo)入CD4+T淋巴細(xì)胞或CD34+的造血祖細(xì)胞，再回輸體內(nèi)。常用的抗病毒基因包括自殺基因、反義RNA、核酶、RNA誘餌的相應(yīng)DNA序列以及調(diào)節(jié)蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白的突變體基因等。由于這些治療基因不能到達(dá)巨噬細(xì)胞和多能干細(xì)胞，因此難以重建免疫；此外，體外操作費(fèi)用昂貴，不適于大規(guī)模應(yīng)用。慢病毒載體的為AIDS的基因治療帶來了新的希望，它可能具有以下優(yōu)勢：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的載體顆?？梢詫⒖共《净蛑苯舆\(yùn)抵CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，適于直接的體內(nèi)治療，而包被了VSV包膜的載體顆粒又能感染多能干細(xì)胞，有利于免疫重建；第二，患者體內(nèi)的野生型HIV-1可將攜帶抗病毒基因的載體拯救出來，使載體擴(kuò)增并擴(kuò)散到周圍更多的細(xì)胞中發(fā)揮抗病毒作用；第三，如果將抗病毒基因置于HIV-1本身的長末端重復(fù)序列(LTR)控制之下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，則只有當(dāng)HIV-1感染該細(xì)胞時，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才會表達(dá)，使基因表達(dá)具有了靶向性。

Lesch-Nyhan綜合征是一種遺傳性的代謝性腦病，由編碼次黃嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一種退行性腦病，由于產(chǎn)生多巴的神經(jīng)元退化，導(dǎo)致大腦紋狀體內(nèi)多巴胺水平降低，臨床上給患者注射左旋多巴可改善癥狀，但長期注射及藥物的副作用令患者難以承受。較為理想的方式是在腦內(nèi)持續(xù)表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)，使其催化酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)闉樽笮喟?；Alzheimer氏病也是一種多因素引起的退行性腦病，造成大腦皮質(zhì)和海馬回神經(jīng)元萎縮，通常采用神經(jīng)營養(yǎng)因子防止神經(jīng)元退化。由于慢病毒載體能夠體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元并建立長期穩(wěn)定的表達(dá)，因此對于以上疾病的基因治療非常具有吸引力。可以設(shè)想，分別將編碼HPRT、TH或神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因通過慢病毒載體介導(dǎo)，體內(nèi)注射至神經(jīng)元，有可能對上述疾病產(chǎn)生良好效果。

造血干細(xì)胞一直被認(rèn)為是對血液系統(tǒng)惡性腫瘤或其它疾病(如地中海貧血、鐮刀性紅細(xì)胞貧血、血友病等)進(jìn)行基因治療的理想靶細(xì)胞，但由于缺乏使目的基因在造血干細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的，這方面的研究進(jìn)展不明顯。盡管小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)細(xì)胞因子刺激后進(jìn)入細(xì)胞周期的造血干細(xì)胞，但經(jīng)此處理的干細(xì)胞性質(zhì)可能會發(fā)生改變。慢病毒載體則可通過直接轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止的干細(xì)胞避免這類。將多藥耐藥(MDR)基因?qū)朐煅杉?xì)胞，可使其耐受大劑量化療，可能成為治療白血病和其它惡性腫瘤的有效途徑；將正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分別導(dǎo)入造血干細(xì)胞，有望對地中海貧血、鐮刀性紅細(xì)胞貧血和血友病產(chǎn)生療效。

存在問題

盡管慢載體的研究有了很大進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，除Naldini等報道的結(jié)果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；其次，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困 難，已建立的包裝細(xì)胞均不理想。據(jù)報道，Vpr是一種使細(xì)胞進(jìn)入靜止期的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，也是建立包裝細(xì)胞的主要障礙之一。如果確如前文所述，包裝質(zhì)粒中的vpr基因并非必需、去除后不影響載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，則建立穩(wěn)定的包裝細(xì)胞是大有希望的。

在保證HIV-1載體的安全性上，迄今已做了種種努力，要產(chǎn)生有復(fù)制力的HIV，必須在不同的質(zhì)粒上發(fā)生多次非同源重組事件。即使如此，一旦用于人體試驗(yàn)，仍然不能打消人們對感染有復(fù)制力的HIV-1的顧慮。更為謹(jǐn)慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建載體，如猴免疫缺損病毒(SIV)、貓和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等，而這些工作尚屬空白。

參考資料