動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)的產(chǎn)品）

特點(diǎn)

乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的外源蛋白種類(lèi)廣泛，從小分子肽到大分子復(fù)雜蛋白質(zhì)，從生物活性酶到抗體、病毒抗原蛋白均可有效生產(chǎn)。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的優(yōu)點(diǎn)有：（1）生物活性高，無(wú)污染。動(dòng)物乳腺有完整的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，從而保證了產(chǎn)品的高生物活性。（2）易分離提純，成本低廉；現(xiàn)有的一些人藥物蛋白之所以昂貴，除了原料難以收集外，另一原因是分離提純極為困難成本極高。而動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)物直接經(jīng)乳汁分泌出體外，只需用常規(guī)方法除去酪蛋白沉淀乳清，再經(jīng)層析即可得到重組蛋白，已經(jīng)建立起完整的分離純化生產(chǎn)程序。（3）產(chǎn)量高。外源基因在動(dòng)物乳腺中的表達(dá)量可以達(dá)到每升幾克到幾十克，小群轉(zhuǎn)基因大家畜的產(chǎn)量即可滿(mǎn)足全世界市場(chǎng)的需求。動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域最具開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的尖端方向。

發(fā)展簡(jiǎn)史

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究始于20世紀(jì)80年代初。1980年，Gordon等將重組DNA用顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵原核，首次獲得了整合有外源基因的小鼠。1982年，Palmiter等將大鼠生長(zhǎng)激素基因顯微注射到小鼠受精卵中，首次獲得了體重為正常小鼠2 倍以上的“超級(jí)小鼠”并提出了從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中提取藥物蛋白的設(shè)想。此后幾年的許多研究奠定了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)體系的基礎(chǔ)，但真正的乳腺生物反應(yīng)器研究則始于1987 年Gordon 等的工作，他們將組織型纖溶酶原激活劑（tPA）與小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的啟動(dòng)子構(gòu)成重組基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表達(dá)tPA 的轉(zhuǎn)基因小鼠，同年，世界上第一只能從乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的轉(zhuǎn)基因綿羊在英國(guó)羅斯林研究所誕生。從此，開(kāi)始了乳腺生物反應(yīng)器的實(shí)用性研究。

Simons等（Simons等，1987年）將帶MT啟動(dòng)子的β-乳球蛋白-凝血因子IX（BLG-FIX）、BLG-AAT 等重組DNA片段注射到綿羊受精卵中，獲得了在乳汁中有外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代。Wilmut等將羊乳球蛋白基因片段與F-IX和AAT-cDNA 融合質(zhì)粒注入小鼠及綿羊受精卵中，獲得乳汁中含F(xiàn)-IX 和AAT 的轉(zhuǎn)基因小鼠及綿羊。Wright等將綿羊BLG基因調(diào)控區(qū)與人AAT基因相連，獲得了 4 只轉(zhuǎn)基因綿羊。Velander 等利用WAP 基因啟動(dòng)子與人蛋白質(zhì)C（hPC）cDNA 重組基因獲得的轉(zhuǎn)基因豬，重組hPC的表達(dá)量（1g/L）比人血中hPC　濃度還高200倍。Ebert等用β-CA基因的啟動(dòng)子引導(dǎo)tPA在山羊乳汁中得到表達(dá)（1-3g/L）。Wilmut等（Wilmut等，1997年）首創(chuàng)體細(xì)胞克隆技術(shù)并成功構(gòu)建了表達(dá)人F-IX的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。2000年，英國(guó)PPL 公司將人類(lèi)AAT 基因定點(diǎn)整合到胎兒成纖維細(xì)胞的前膠原基因座，用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因打靶綿羊（McCreath等；2000年）；2001年，他們又利用基因打靶技術(shù)生產(chǎn)出了AAT、3-GT 和朊病毒雙剔除的克隆綿羊。上述研究可以看出，乳腺生物反應(yīng)器研究從模式動(dòng)物——小鼠的轉(zhuǎn)基因開(kāi)始，逐步建立起了大動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的技術(shù)平臺(tái)。

我國(guó)的施履吉院士在20世紀(jì)80年代初就提出了乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)想并獲得了表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔。1996 年10 月，復(fù)旦大學(xué)遺傳所和上海醫(yī)學(xué)遺傳所合作成功地獲得了表達(dá)有活性的F-IX蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠和5只轉(zhuǎn)基因綿羊，真正開(kāi)始了我國(guó)的乳腺反應(yīng)器構(gòu)建工作。1998年，上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所構(gòu)建成以牛酪蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)F-IX基因表達(dá)的表達(dá)載體，顯微注射到山羊受精卵的雄原核，成功制備了5頭轉(zhuǎn)基因羊。上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所于1999年2月，得到一頭帶有人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因牛。2000年，中國(guó)農(nóng)大和北京興源生物科技中心合作，將改造的人AAT 基因顯微注射到山羊受精卵原核中，獲得了3只帶有人AAT 的轉(zhuǎn)基因山羊。2005年青島森淼公司與中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等科研院所聯(lián)合開(kāi)展，選用嶗山奶山羊完成了人的乙肝表面抗原、抗凝血酶AT-Ⅲ、人β-干擾素等三種轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，并完成了羊胎兒成纖維細(xì)胞株的建立，應(yīng)用細(xì)胞核移植技術(shù)成功獲得了克隆奶山羊。近幾年來(lái)的成功報(bào)道仍限于顯微注射等常規(guī)方法，離國(guó)外尚有一定差距。

表達(dá)載體

制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵是保證目的蛋白特異性在乳腺中的高效表達(dá)，傳統(tǒng)表達(dá)載體都是選用某種乳蛋白基因的調(diào)控序列作為啟動(dòng)子元件。目前，已經(jīng)克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白（BLG）基因、aS1-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清白蛋白基因。

目的基因

十多年來(lái)，已有數(shù)種高價(jià)值的產(chǎn)品在大動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)出來(lái)，于小鼠乳腺中獲得表達(dá)的產(chǎn)品更是多達(dá)數(shù)百種。從國(guó)際大公司開(kāi)發(fā)的情況可以看出，高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的醫(yī)用蛋白和營(yíng)養(yǎng)蛋白是重要的研發(fā)對(duì)象，如AT一Ⅲ、AAT、蛋白C、乳鐵蛋白、乳糖酶等都已進(jìn)入了三期或二期臨床試驗(yàn)階段。選擇目的基因應(yīng)當(dāng)首先考慮那些正常情況下來(lái)源困難或濃度低，其他表達(dá)系統(tǒng)難以生產(chǎn)且I臨床應(yīng)用前景廣闊的蛋白基因。可以預(yù)見(jiàn)，由于細(xì)胞工程和基因治療技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞因子類(lèi)產(chǎn)品將不會(huì)通過(guò)動(dòng)物乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)，而用途更廣、需求量更大的治療性抗體、營(yíng)養(yǎng)蛋白和工程酶將成為制備乳腺生物反應(yīng)器的首選靶蛋白。另外，若能建立起穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因家畜群，以乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程疫苗，不僅生產(chǎn)效率可觀，而且可直接以乳汁進(jìn)行臨床免疫，達(dá)到方便快捷的目的。

關(guān)鍵技術(shù)

現(xiàn)有的應(yīng)用于動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有：

1 顯微注射法

2 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法

3 配子介導(dǎo)法

4 胚胎干細(xì)胞（ES）介導(dǎo)法

5 核移植介導(dǎo)法

還有利用同源重組原理發(fā)展起來(lái)的基因打靶（敲除）技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞克隆，正成為動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制備的新研究熱點(diǎn)。

問(wèn)題展望

在乳腺反應(yīng)器研制中尚存在下述待解決的難題：（1）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率低。（2）目的蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于乳汁中總蛋白含量。（3）目的基因的分離、改造、載體構(gòu)建、體細(xì)胞克隆等技術(shù)環(huán)節(jié)還不夠成熟。（4）“位置效應(yīng)”與“劑量效應(yīng)”目前無(wú)法克服。（5）乳汁蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理、目的基因在宿主染色體上整合的詳細(xì)機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控元件在不同家畜表現(xiàn)差異的原因、乳腺細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工修飾機(jī)理等還未弄清。（6）產(chǎn)品的安全性的問(wèn)題，外源基因侵入對(duì)動(dòng)物和基因藥物對(duì)人體正常功能有何影響，否會(huì)造成基因污染，尚難定論。

雖有這些問(wèn)題存在，但許多國(guó)家政府和大型制藥企業(yè)仍競(jìng)相投入巨資資助乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)，使乳腺反應(yīng)器研制和產(chǎn)業(yè)化呈現(xiàn)日益加速的趨勢(shì)。利用乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)活性蛋白，如需求量極大的護(hù)膚品中的活性蛋白，或者改造奶質(zhì)而使其具備營(yíng)養(yǎng)和藥用雙重功能，或者直接生產(chǎn)口服生物制品，都具有極大的市場(chǎng)潛力。我們相信乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)不僅會(huì)成為有高額利潤(rùn)回報(bào)的新型行業(yè)，而且將會(huì)帶動(dòng)整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，形成全新的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)模式。因此，我們應(yīng)當(dāng)抓住機(jī)遇，增加投資力度，大力興辦乳腺反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)，以在未來(lái)的生物高技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)中奪得主動(dòng)權(quán)。