絕對(duì)計(jì)數(shù)（按實(shí)際檢測(cè)結(jié)果計(jì)數(shù)的方法）

概念

傳統(tǒng)的CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的檢測(cè)方法是通過(guò)計(jì)數(shù)外周血總白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比來(lái)計(jì)算T淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)。這一方法需用手工或血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來(lái)計(jì)數(shù)總白細(xì)胞(W BC)和各分類(lèi)白細(xì)胞，再用流式細(xì)胞儀或顯微鏡得出淋巴細(xì)胞亞群百分比，相乘得出 CD4T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。這種雙平臺(tái)方法由于多步驟測(cè)定方法，得到的結(jié)果誤差很大，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

FACSCount系統(tǒng)是BD公司最近研發(fā)的一個(gè)是專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用來(lái)自動(dòng)計(jì)數(shù) CD3 ，CD3 CD4 (CD4 )，CD3 CD8 (CD8 )陽(yáng)性細(xì)胞及 CD4 /CD8 比值的集成細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，樣本標(biāo)記步驟簡(jiǎn)捷，可以直接測(cè)量T細(xì)胞各亞群細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量而無(wú)須計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比。相關(guān)研究選用另一種單平臺(tái)計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞各亞群的方法，以FACS M ultiSET系統(tǒng)作為參照系統(tǒng)來(lái)比較兩個(gè)系統(tǒng)得到數(shù)據(jù)的精確性、重復(fù)性以及操作特點(diǎn)等，評(píng)價(jià)使用 FACSCount系統(tǒng)臨床應(yīng)用的可行性。

計(jì)數(shù)與分析

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）是一種B細(xì)胞的惡性腫瘤，中老年人常見(jiàn)，以骨髓中積聚大量的惡性漿細(xì)胞并分泌單克隆免疫球蛋白為特征。骨髓瘤的臨床表現(xiàn)較復(fù)雜，而且影響預(yù)后的因素也很多，生存期從數(shù)月到數(shù)十年不等。傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)包括年齡、漿細(xì)胞指數(shù)、β2-微球蛋白（β2-MG）、分子細(xì)胞遺傳學(xué)等。有文獻(xiàn)報(bào)道外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（absolute lymphocyte count，ALC）也成為惡性血液病的預(yù)后因素之一。

同時(shí)有研究證實(shí)初發(fā)時(shí)ALC較低的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤患者的生存期較短，預(yù)后較差，但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于ALC與MM預(yù)后的相關(guān)性研究較少。因此對(duì)102例初發(fā)的MM患者進(jìn)行回顧性分析，分析ALC與患者各項(xiàng)臨床特征和其他預(yù)后因素的相關(guān)性，推測(cè)ALC作為MM預(yù)后指標(biāo)的可行性及臨床應(yīng)用價(jià)值。

（1）方法

回顧性分析了102例骨髓瘤患者，查閱并記錄患者年齡、性別、ALC、乳酸脫氫酶（LDH）、白蛋白（ALB）、β2-MG、肌酐（Cr）及其總生存期（overall sur?vival，OS）以相應(yīng)ALC的中位數(shù)分組，后統(tǒng)計(jì)ALC與

其他各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性。隨訪截止日期為2012年2月29日。總生存時(shí)間的計(jì)算為疾病確診時(shí)間至死亡或末次隨訪的時(shí)間段。所有失訪患者均計(jì)算至末次隨訪日止，按截尾數(shù)據(jù)處理。隨訪方法采用電話隨訪。

（2）統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS10.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間計(jì)數(shù)資料采用χ 檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。對(duì)生存概率的估計(jì)采用Kaplan-Meier法，并用Log-rank法對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

機(jī)體的免疫狀態(tài)和惡性血液病的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后有很大關(guān)系，ALC代表患者的免疫狀態(tài)，也是影響其預(yù)后的因素之一。有文獻(xiàn)報(bào)道ALC不僅可預(yù)測(cè)非霍奇金淋巴瘤預(yù)后，對(duì)霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、急性白血病、卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、進(jìn)展期軟組織肉瘤等也具有預(yù)后價(jià)值。ALC減少與不良預(yù)后之間的關(guān)系機(jī)制尚不清楚，可能與ALC減少與機(jī)體免疫抑制相關(guān)，反映機(jī)體免疫功能低下；淋巴瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)淋巴細(xì)胞具有毒性溶解作用，導(dǎo)致ALC減少。上述兩種因素共同存在，也可能存在其他未知因素。Brown等的研究發(fā)現(xiàn)，MM患者體內(nèi)有

著免疫系統(tǒng)的多種缺陷，而且免疫功能的缺陷作為該病的一個(gè)重要特征影響著疾病的進(jìn)程，只是具體免疫功能缺陷的分子機(jī)制尚不明確。

有研究報(bào)道，淋巴瘤患者自體造血干細(xì)胞移植后ALC>0.5×10 /L的患者中位OS及疾病無(wú)進(jìn)展生存率（PFS）明顯高于ALC<0.5×10 /L的患者。Ege等發(fā)現(xiàn)MM患者ALC<1.4×10 /L，OS較短。本研究發(fā)現(xiàn)初發(fā)時(shí)ALC>1.51× 10 /L 的患者中位OS明顯高于ALC<1.51×10 /L的患者，與文獻(xiàn)基本一致。說(shuō)明ALC對(duì)MM預(yù)后的判斷有一定的幫助性。

Bradwell等研究證實(shí)血清游離輕鏈和β2-MG與MM預(yù)后相關(guān)。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道血清LDH越高，腫瘤惡性程度越高，預(yù)后也越差。Palumbo等研究發(fā)現(xiàn)，患者的年齡對(duì)于個(gè)性化治療有重要影響，患者年齡>75歲是其預(yù)后不良的影響因素之一，年齡越大，預(yù)后越差。Barlogie等的研究發(fā)現(xiàn)高LDH和血鈣水平等指標(biāo)影響了MM患者的早期生存，而年齡和β2-MG可影響長(zhǎng)期生存。還有文獻(xiàn)顯示LDH水平是MM的一項(xiàng)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，可以作為評(píng)估疾病進(jìn)

展及預(yù)后狀態(tài)的重要指標(biāo)。本組實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，初發(fā)時(shí)高水平 ALC 的 MM 患者發(fā)病年齡、血清LDH及β2-MG均低于低水平 ALC的患者，由此可以推測(cè) ALC 與其他預(yù)后指標(biāo)結(jié)合，對(duì)于患者的預(yù)后有重要意義。

近年來(lái)預(yù)測(cè) MM的預(yù)后變得更加復(fù)雜，與之有關(guān)的預(yù)后因素的研究也不斷涌現(xiàn)。本研究通過(guò)分析ALC與患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)和總生存期的相關(guān)性，ALC較高的患者發(fā)病年齡較低，血清LDH值及β2-MG較低，同時(shí)總生存期較長(zhǎng)。因此可以推測(cè)ALC可作為MM獨(dú)立的預(yù)后因素之一。ALC檢測(cè)簡(jiǎn)潔方便，費(fèi)用低，對(duì)患者的負(fù)擔(dān)小，便于普及使用于任何類(lèi)型的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。同時(shí)耗時(shí)較短，可以及時(shí)為臨床醫(yī)生提供第一手的信息，方便及早干預(yù)治療。由于本研究樣本例數(shù)有限，未對(duì)患者的分子細(xì)胞遺傳學(xué)改變進(jìn)行隨訪，因此未找到 ALC與分子細(xì)胞遺傳學(xué)的相關(guān)性，

有待增加樣本加強(qiáng)隨訪，進(jìn)一步分析。

方法

干細(xì)胞移植對(duì)于白血病等多種疾病的治療具有重要意義，而準(zhǔn)確的干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)對(duì)于干細(xì)胞移植的成敗又十分重要。流式細(xì)胞儀結(jié)合熒光單抗技術(shù)為干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)提供了一種快速、定量、重復(fù)性好的方法。

干細(xì)胞計(jì)數(shù)是根據(jù)血液中不同血細(xì)胞的特性，選擇特異性標(biāo)記物，采用多參數(shù)分析的方法，排除細(xì)胞之間的干擾，識(shí)別出不同的細(xì)胞并分類(lèi)計(jì)數(shù)。具體而言，針對(duì)干細(xì)胞核酸含量高、大小與大淋巴細(xì)胞相近、粒度與淋巴細(xì)胞相似、CD45 表達(dá)弱、CD34 表達(dá)強(qiáng)的特點(diǎn)，首先可通過(guò)核酸染料標(biāo)記所有的有核細(xì)胞(包括白細(xì)胞和幼稚的紅細(xì)胞)，排除細(xì)胞碎片及無(wú)核細(xì)胞；其次通過(guò)抗CD45抗體標(biāo)記所有白細(xì)胞，并根據(jù)CD45表達(dá)強(qiáng)度的不同區(qū)分不同的白細(xì)胞，從而排除CD45表達(dá)強(qiáng)的細(xì)胞，避免CD45弱表達(dá)細(xì)胞的丟失；然后用抗CD34抗體標(biāo)記CD34陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，即干細(xì)胞。總之，通過(guò)核酸量、SSC的強(qiáng)度、CD45和CD34的表達(dá)量等多個(gè)參數(shù)將干細(xì)胞與淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、血小板團(tuán)塊以及紅細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。

同時(shí)，樣品管中還加有已知數(shù)量的三色標(biāo)記的易于與細(xì)胞區(qū)分的熒光微球作為絕對(duì)計(jì)數(shù)的內(nèi)標(biāo)。根據(jù)所采集到的干細(xì)胞數(shù)與熒光微球數(shù)目的比值，再乘以樣品管中的熒光微球數(shù)，即為樣品管中干細(xì)胞的數(shù)目，再除以樣品的體積，即可求得樣品中干細(xì)胞的濃度。

對(duì)于有劑量要求的干細(xì)胞移植方案而言，精確的干細(xì)胞計(jì)數(shù)顯然十分重要。研究表明，需要輸入病人體內(nèi)的 CD34陽(yáng)性細(xì)胞量取決于病人的體重，每公斤體重應(yīng)輸入2百萬(wàn)至5百萬(wàn)個(gè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞。此重要性也顯示在動(dòng)員及白細(xì)胞分離過(guò)程中，如通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞水平判斷動(dòng)員是否成功、何時(shí)為最佳采集時(shí)間以及采集到的干細(xì)胞數(shù)量是否足夠等等。由于干細(xì)胞所占的比例很小，在外周血中不到0.1%，在骨髓中也只占單個(gè)核細(xì)胞的1%至4%，因此利用流式細(xì)胞儀在大量細(xì)胞中快速準(zhǔn)確地篩選并測(cè)出干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量對(duì)于干細(xì)胞移植具有重要意義。