出凝血時間（出凝血時間）

測定方法

出血時間測定有三種方法：即，Duke法、Ivy法、出血時間測定器法。

Duke法

Ivy法

出血時間沉定器法

臨床意義

1.

2.

3.

時間測定

凝血時間試驗是指血液自血管抽出放入試管中，從液態(tài)的溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)為半固體凝膠狀態(tài)所需要的時間。出血后，血液(或血漿)中的Ⅻ因子被激活后，處于酶原狀態(tài)的凝血因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ⅹ,Ⅴ依次被激活，連續(xù)"放大"，最終使纖維蛋白原生成纖維蛋白。后者呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)羅血小板栓子和紅細胞后，收縮形成牢固的血塊。這一過程需要Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅴ、Ca2+、凝血酶原及纖維蛋白原等凝血因子的參與，其中任一因子缺乏均可引起上述"連續(xù)放大"過程障礙，造成凝血不良。因此凝血時間延長，可反映上述因子缺乏。此試驗反映記錄的是整個凝血過程，對Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子較為敏感，只有凝血酶原,凝血因子X,纖維蛋白原明顯減低時才顯示實驗結(jié)果延長。

凝血時間實驗大致有6種測定方法。王鴻利等用6種凝血時間測定對12例重型血友病（Ⅷ因子活性<1%），4例中型血友病（Ⅷ因子活性1%~5%）進行測定，結(jié)果（檢出率/病例數(shù)）為：毛細血管法，重型1/12，中型0/4；玻片法，重型2/12，中型0/4；普通試管法，重型12/12，中型2/4；APTT，重型12/12，中型4/4；硅化管，重型12/12，中型4/4；ACT法，重型12/12，中型4/4。從中可以看出，毛細血管法和玻片法很不敏感，不能再用于Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ因子的篩選實驗。普通試管法簡單且較敏感，標本用量較少，可用于常規(guī)檢查，但由于手工操作，需注意實驗器材的標準化。APTT簡便快速，市面上有各型凝血儀，可用于不同規(guī)模實驗室，且有配套的試劑、質(zhì)控物、校準物，易于質(zhì)量控制，是較理想的常規(guī)實驗方法。APTT也可手工完成，但影響因素較多，在標本量較多時，不適用。

臨床意義

1.

2.

指標診斷

為了避免術(shù)中出血，手術(shù)前進行出血傾向的檢查非常必要，由于影響止血的因素很多，但又不可能做許多實驗，因此，以往常規(guī)中用出血時間和凝血時間作為診斷指標，結(jié)果異常時再進一步做較復雜的試驗尋找病因。前已述及,Duke法雖簡單適于常規(guī)應用，但敏感性很差，不能達到診斷要求，而出血時間測定器方法，操作復雜，費時，不適合常規(guī)使用。雖是反映血管，血小板數(shù)量和質(zhì)量方面的病理變化，但臨床最常見的是血小板減少引起變化。而血管性疾病和血小板質(zhì)量異常引起的疾病多是遺傳性疾病,發(fā)病率很低，且基本上能在臨床表現(xiàn)，體征和病史中反映出來，可提示做一些確診試驗。從這個意義上講，手術(shù)前只要做一項血小板計數(shù)而不做出血時間，也基本上能保證手術(shù)前篩查的要求。

APTT法僅對凝血階段Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子敏感。為此，在進行APTT檢測同時還應再檢查PT,以保證能檢出由于凝血酶原,Ⅴ因子,Ⅵ因子缺乏而引起的出血傾向。

注意事項

1.PT,APTT凝血實驗檢查均使用靜脈血。采血人員應技術(shù)熟練，以防止組織損傷，外源性凝血因子進入針管.

2.凝血實驗標本最好不與其他實驗一起采集，否則由于標本的分配，分裝等使用血液停留在針管的時間延長。一般血液采集，進入容器至進行實驗所用的時間越短，所分析的凝血因子被保護得越好。從輸液三通管取出血的做法不可取.

3.取血時病人應松弛，環(huán)境溫暖，防止靜脈攣縮,止血帶的壓力要盡可能小，壓力大及束縛時間長可影響局部血液的濃縮和內(nèi)皮細胞釋放組織纖溶酶原活物(t-PA),后者將引起纖溶性增強，血小板短和內(nèi)徑應標準化，國際上推薦用21G1.5或20G1.5針頭。取血時，拉針栓的速度要慢而均勻，使血液平穩(wěn)地進入注射器，防止氣泡的產(chǎn)生.

4.一旦取樣完畢，立即與抗凝劑充分混合，一般提倡使用真空采血管。此管有充分的透明度，根據(jù)取血量設(shè)計，有2.0,5.0,10ml各種血液收集管，真空負壓并有定量的抗凝劑，能保證抗凝劑與取血量的比例，且能有充分的空間便于血液和抗凝劑混合.

5.用硅化玻璃或塑料注射器采血。考慮結(jié)果的精確性，應將試管刻度的可能誤差控制在既定體積的10%以內(nèi).

6.采血后標本在低溫保存且在一定時間范圍內(nèi)。筆者曾對不同條件保存的血漿因子變化進行了探討，結(jié)果顯示在32℃保存血漿6,12,24hⅧ因子活性可分別消失50%,60%95%,即使保存在4℃也分別消失5%,55%,70%.V因子活性在32℃分別消失25,40,80%,而在4℃則僅損失0%,5%,10%.因此測定APTT的血漿在-80℃至少可保存1個月,4℃為6h,20℃為6h,而32℃僅為血漿，在4℃為24h,20℃為6h,32℃為2h.

7.國際血液學標準化委員會(ICSH),國際血栓與止血委員會(ICTH)推薦使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mol/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。另外，近年來，許多試驗室采用緩沖抗凝劑，這種試劑對標本經(jīng)冷凍保存后再行分析更為適宜。因為無緩沖劑，血漿pH值隨時間而增加，凝固時間可延長，特別是Ⅷ因子即使是在-20℃保存，其凝血活性也可減少50%.緩沖劑的作用是維持血漿恒定pH,防止易變因子失活?？鼓齽┰谘獦吮镜慕^對含量可改變血漿中鈣離子濃度，進而影響試驗結(jié)果，一定要注意采血時血液與抗凝劑的比例。應指出，所謂血液與抗凝劑按9:1比例混合，實際上是指抗凝劑與正常壓積血液之間的比例而言。因此應根據(jù)患者紅細胞比例(Hct)狀況隨時調(diào)整抗凝劑用量.

1.凝血活酶應注意的問題:

(1)組織凝血活酶標準化應用的國際參考品(internationalreferencepreparation,IRP),有下列幾種：單一組織凝血活酶國際參考品：是一種組織提取物的生理鹽水懸液制劑.WHO在英國使用的統(tǒng)一標準的"英國比較凝血活酶",編號67/40.同時又以BCT67/40為基礎(chǔ)標準化了次級參考品。如牛腦組織凝血活酶，編號68/434;兔腦為70/178等.復合組織凝血活酶國際參考品：它是組織提取物的生理鹽水懸液中加入適量纖維蛋白原,因子V和氯化鈣組成的制劑，如牛組織凝血活酶OBT/79等.

(2)組織凝血活酶工作制劑的國際敏感指數(shù)(ISI),由于不同組織凝血活酶對凝血因子的敏感性不同。為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測PT中能得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個共同的敏感性指標。自制的試劑要與國際參考品(IRP)進行比較，然后得出一個校正值(即ISI).ISI值越接近于1.0,表明組織凝血活酶試劑越敏感，因此,生產(chǎn)和出售得產(chǎn)品必須標有ISI.

(3)儀器特有的ISI:上述PT根據(jù)報告方式適用于手工法(試管傾斜法)測定PT.但是手工法與儀器法以及儀器法與儀器法測定PT的國際標準化比值(INR)之間，仍有差異。為此，專家們提出建議：同一組織凝血活酶試劑用于不同儀器時，可用所謂的"儀器特有的ISI"或稱區(qū)域性ISI來計算INR.每臺儀器所用的凝血活酶試劑都應該有特定的ISI值，重新標定ISI值的做法是購買標有INR的凍干血漿，然后在自己的儀器上再標定所使用凝血活酶試劑的ISI值，這樣才可使病人的INR具有可比性.

(4)某些凝血活酶和部分活化凝血活酶并不一定與某此儀器相匹配。渾濁的或含微粒的凝血活酶和部分活化凝血活酶不能運用通過光學系統(tǒng)測定終點的儀器進行檢測.

(5)凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步驟必須嚴格按照說明書進行。通常在使用前必須充分混勻試劑，以使微粒重新均勻懸浮于液體中。按說明書要求的溫度存放試劑，并且試驗過程中，將試劑置于37℃下的時間不能長于說明書中規(guī)定的溫度.

(6)做APTT實驗時所用的活化劑不同，對血內(nèi)肝素,狼瘡抗凝物質(zhì)及因子Ⅷ,Ⅸ缺乏癥的敏感性也不同，要根據(jù)檢測項目來選擇不同活化劑的APTT試劑。同樣PT延長時反遇有關(guān)凝血因子中單一因子或幾個因子缺陷引起的病理現(xiàn)象，由于不同疾病可能僅反映某一因子的變化，因此一種特定試劑不可能對這些疾病的變化的敏感性一致。由于不同廠家生產(chǎn)的PT試劑質(zhì)量不同，因此，同一份標本用不同PT試劑其結(jié)果可有明顯的差異。因此PT實驗最好采用INR的報告方式.

2.試劑準備過程中應該使用去離子水。如果pH值增高的水沒有得到適當?shù)木彌_，將會延長測定結(jié)果。如果用含氨的水配制抗凝劑，會導致V因子活性快速降低，從而延長凝血酶原時間。凝血活酶，部分活化凝血活酶，緩沖液和抗凝劑須在4-10℃條件下貯存，但在室溫下保存氯化鈣和水.

3.正常對照血漿通常將多份健康人血標本混在一起，以彌補個體誤差。正常對照血漿要求20份以上健康，年齡在18-55歲間的男女個體，且刪除服藥者，須在平靜，休息狀態(tài)抽血。樣本離心取出血漿后混勻，分裝小瓶，凍存于-80℃?zhèn)溆?，或冷凍干?

4.參比血漿：標準化是質(zhì)控的重要組成部分，方法標準化對有的實驗室來說是困難的，因有設(shè)備條件方面的限制。為了使結(jié)果大同一實驗室的不同時期具有可比性，必須使用標準品或參比血漿.WHO已建立了10多種國際標準品.

1.玻璃器皿的要求：貯存和測試時應選用干凈，沒有劃痕的試管。酸清洗法(鹽酸3mol/L)被公認為適用于凝血研究清洗玻璃制品的最佳方法。玻璃制品必須通過徹底沖洗，以去除殘留的酸，避免改變?nèi)萜鞅砻娴膒H值。一次性玻璃和塑料制品分開保存。手工法PT或試管法全血凝固時間測定時，試管口徑為8mm,直徑越大,CT越長.

2.溫度的要求：人工測定終點法要求水浴箱的溫度必須保持在(37±1)℃,并且周圍照明設(shè)備要好，便于讀取終點。如果為了讀數(shù)而將試管從水浴箱中拿出，傾斜觀察，此時動作應迅速，否則試管中的血漿溫度將很快下降.

3.儀器的選擇：自動終點測定法有半自動和全自動兩種類型，區(qū)別在于前者在試劑和血漿移液步驟上仍是手工的；而后者完全由儀器自動操作。自動終點法測定所得結(jié)果重復性好，大大提高了不同試驗室結(jié)果間的可比性.

應該根據(jù)儀器的精密度，可靠性，使用和維修的簡易程度來選擇所購買儀器?，F(xiàn)在已有不少用合成底物法代替以凝固為終點的生物學測定法的報道。但是，這兩種測定方法的臨床意義不盡相同.

1.許多試驗誤差都來源于技術(shù)的錯誤。在實驗技術(shù)，試劑，溫度及pH值上很微小的變化都會導致試驗結(jié)果明顯的變化。孵育時間與溫度是在一期法凝血酶原時間測定時應嚴格控制的參數(shù)。血漿不能在37℃下放置超過10min,凝血活酶放置時間也不能超過說明規(guī)定的時限.

2.手工法PT或試管法CT檢查時，傾斜試管動作一定要輕，角度要小，以減少血液與管壁的接觸面積。同一標本要做二管(有文獻報告試管法CT檢查要3管)并取均值報告。每批實驗必須有正常對照.

3.血液凝固主要是酶催化的反應，所以實驗過程中要嚴格控制理想的pH環(huán)境和溶液的離子強度.多數(shù)常規(guī)試驗都在處于血液生理pH值緩沖范圍的緩沖系統(tǒng)中進行。反應混合物的pH值必須處于7.2-7.4之間.

4.試驗結(jié)果準確還取決于所用的反應物的量，加入順序和不同反應物的孵育時間。如每次APTT試驗時，活化部分凝血活酶試劑和血漿混合物的孵育時間必須一致.混勻過程決定了APTT試驗中接觸活化的量，在孵育時如果在活化部分凝血活酶與血漿混合的技術(shù)不佳，將會改變測定結(jié)果。

5.APTT,PT需乏血小板血漿。一般3000r/min離心10min后分離血漿。離心前注意標本量，離心后注意血漿的量(Hct)以保證抗凝劑與標本量最適比例.

6.試驗前檢查血漿是否有溶血,黃疸,脂血和出現(xiàn)凝塊.紅細胞膜含有磷脂，溶血標本具有與血小板第Ⅲ因子(磷脂)相似的凝血活性，這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標本中如果出現(xiàn)凝塊，無論凝塊多么小，均會影響試驗結(jié)果.

7.報告方式:(1)以PT的秒(s)數(shù)報告.(2)以患者PT(s)/正常對照(s)的比(PTR)報告.(3)在口服藥物治療監(jiān)控時以INR報告.(4)ICSH規(guī)定，不再用百分比(活動度)報告.(5)APTT以秒報告。

繪制質(zhì)控圖并隨時分析其變化趨勢是質(zhì)量控制的重要手段。在每天工作中，同時測正常和氨基常對照血漿(商品或自制),并用Levey-Jeuny質(zhì)控圖檢查有無失控。其步驟為，首先在常規(guī)的實驗條件下(包括高素質(zhì)的實驗人員，規(guī)范的操作，穩(wěn)定的儀器),對質(zhì)控品至少進行10次測量，計算出X及標準差，然后繪出質(zhì)控圖，質(zhì)控物的X值為基線，縱軸有X±2s.每次試驗時質(zhì)控物與標本一起檢測，并把當日的結(jié)果點在圖表上。下列的質(zhì)量變化圖形有利于操作人員判斷結(jié)果是否有所失控。當失控時，按下述步驟(圖1)檢查原因.

室間質(zhì)評：各實驗室必須積極參加由檢驗中心組織的室間質(zhì)評活動，以便了解本單位的結(jié)果準確性,因儀器和試劑不同，同一份質(zhì)控血漿可行到不同結(jié)果，應將回報結(jié)果根據(jù)儀器試劑分組比較.

參考值

文獻報道，手工法APTT的參考值為31.5-43.5s，女性為32-43s.兩者無顯著差異。

受檢查的測定值較正常對照延長超過10s以上才有病理意義。手工法PT參考值為11-14s，超過正常對照3s為異常，PTR參考值為1±0.15.

因儀器、試劑的不同，會得到不同的結(jié)果，因此儀器法很難規(guī)定統(tǒng)一的參考值，各實驗室應根據(jù)自己的儀器、試劑等條件，自行測定一批健康人，建立參考值。此后至少每年或條件有變化時，根據(jù)新的條件，重新建立參考值。至少選擇40名18-55歲之間男性及非妊娠，月經(jīng)期女性(男女各半)、身體健康，半月內(nèi)無服藥史，在平靜休息的狀態(tài)采血且分開幾天采血和測定(以減少批間差異).在常規(guī)檢測示本的條件下進行試驗。測定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，計算標準差，取95%可信限為參考值范圍。