納豆激酶 納豆發(fā)酵過程中產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶
納豆激酶3D結(jié)構(gòu)圖
納豆激酶是(Nattokinase,簡稱NK)一種由 枯草芽孢桿菌 分泌的 絲氨酸蛋白酶 ,這種激酶主要是在 納豆 發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種活性物質(zhì)。 納豆激酶的分子量為27.7kDa,是一種單鏈多肽酶,由275個(gè)氨基酸殘基組成。 納豆激酶可以通過降解血栓中的纖維蛋白從而發(fā)揮溶栓的效果。 納豆激酶具有藥效時(shí)間長,成本低,安全性高,因此納豆激酶在作為新一代血栓藥物具有非常大的應(yīng)用潛能,可以通過作為補(bǔ)充劑添加在藥品中用來溶栓或降血脂還可以作為食品添加劑。 納豆激酶還具有降血壓,抗菌抗氧化,預(yù)防癌癥等多種有效的生理調(diào)節(jié)功能,因此納豆激酶產(chǎn)品日益受到世界各國的重視。
發(fā)現(xiàn)歷史 納豆起源于中國的秦漢時(shí)期,是傳統(tǒng)的 發(fā)酵食物 ,在 唐朝 時(shí)期傳入日本,在日本飲食習(xí)慣影響下逐漸演變成現(xiàn)在的納豆,它被認(rèn)為是日本長壽的秘訣。納豆類似于中國的發(fā)酵豆和豆豉,日本將納豆主要作為營養(yǎng)食品,而中國將豆豉作為一種調(diào)味料。 1980年,在美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,日本學(xué)者 須見洋行 發(fā)現(xiàn)納豆發(fā)酵物能將血栓在短短的兩個(gè)小時(shí)就溶解掉1厘米,再經(jīng)過一個(gè)晚上的時(shí)間就將 培養(yǎng)皿 中的血栓完全溶解掉了,相對于傳統(tǒng)的溶栓物質(zhì),這個(gè)新的 溶栓物質(zhì)溶解的速度更快效果更好,由于物質(zhì)是在納豆中提取出來的的,故稱之為納豆激酶。
分子結(jié)構(gòu) 納豆激酶成熟蛋白由275個(gè)氨基酸組成,是一種無二硫鍵單鏈 多肽 酶。 Nakamura( 中村 )在1992年利用 鳥槍法 在大腸桿菌中克隆得到了納豆激酶基因,并測定了納豆激酶的核苷酸序列。 納豆激酶的全長基因序列為1473bp,納豆激酶蛋白N端的29個(gè)氨基酸殘基是信號(hào)肽,第30-106個(gè)氨基酸殘基是前肽,去掉信號(hào)肽的352個(gè)氨基酸組成的產(chǎn)物被稱為納豆激酶酶原。 納豆激酶的3D結(jié)構(gòu)圖可以看出納豆激酶由7個(gè)α-螺旋,9個(gè)β-折疊和2個(gè)Ga 結(jié)合位點(diǎn)以及3個(gè)Trp( 色氨酸 )、12個(gè)Tyr( 酪氨酸 )和3個(gè)Phe(苯丙氨酸)組成。
理化性質(zhì) 納豆激酶是一種白色或淡黃色的固體,無臭味,可溶于水。 納豆激酶的等電點(diǎn)位為8.6±0.3,在pH為7-12較為穩(wěn)定,其pH在7-9的酶活性最為穩(wěn)定,pH<5時(shí)不穩(wěn)定。 但是納豆激酶即使在酸性條件下酶活性也不會(huì)失去,納豆激酶在胃中會(huì)被講解,但在小腸中很穩(wěn)定不會(huì)被降解。 納豆激酶的溶液在45℃以下的活性相對穩(wěn)定,溫度高于60℃時(shí)活性逐漸失去,在反復(fù)凍融5次后,其95%的酶仍能保持其活性。 此外金屬離子也會(huì)影響其活性,Hg2?會(huì)使它完全失活,Mn2?、Zn2?、Co2?、Cu2?和Mg2?對其酶活也有抑制作用,而Ga2?和Mg2?對它的酶活明顯有激活的作用。 納豆激酶具有底物專一性,有特定的蛋白水解位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。
生理作用
溶栓作用 納豆激酶不僅可以溶解已經(jīng)存在的血栓,還可以預(yù)防血栓的形成。 納豆激酶不僅是一種高效并且安全的溶栓活性的 纖溶酶 ,相對于傳統(tǒng)的溶栓藥物還具有溶栓效果好,藥效時(shí)間長,安全無毒副作用,成本低,可口服、還不會(huì)造成出血等優(yōu)勢。 納豆激酶具有多元化的溶栓機(jī)制,不僅可以通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞將 尿激酶 激活,進(jìn)而將纖溶酶原激活為纖溶酶去溶解纖維蛋白,還能直接水解纖維蛋白,改善血液的黏度和增強(qiáng)血管的彈性。
降血壓功效 納豆激酶能在預(yù)防和治療高血壓中發(fā)揮作用。 納豆激酶通過降解血漿中的纖維蛋白來降低血壓,還可以通過阻止血漿血管緊張素Ⅱ水平的升高來抑制高血壓。
調(diào)節(jié)腸道作用 人體腸道中的微生物菌群能夠合成人體生長所必須的維生素,因?yàn)榧{豆激酶是由納豆桿菌所產(chǎn)生的一種蛋白酶,這種蛋白酶在腸道中可以促進(jìn)有益厭氧菌的生長并且還能抑制有害需氧菌的生長;穩(wěn)定性較好的納豆激酶通常不會(huì)受腸道環(huán)境的影響,從而能發(fā)揮較好的作用。
其他作用 納豆激酶可以通過保護(hù)神經(jīng)來細(xì)胞預(yù)防阿爾茲海默癥 ,能修復(fù)受損的學(xué)習(xí)和記憶; 還可以治療 慢性鼻竇炎 ,通過水解纖維蛋白來收縮鼻息肉組織,進(jìn)而緩解慢性鼻竇炎所引起的哮喘。 納豆激酶還對氧化應(yīng)激損納傷LPS誘導(dǎo)的炎癥有幫助 ,在視網(wǎng)膜的新生血管的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。 納豆激酶有治療玻璃體視網(wǎng)膜疾病、長時(shí)間飛行導(dǎo)致的疾病、抗血小板和抗凝作用。
制備方法 納豆激酶的制備方法有兩種:固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。 目前可以產(chǎn)生納豆激酶的微生物菌種主要有芽孢桿菌,海洋生物和假單胞菌,但目前研究最多的還是 枯草芽孢桿菌 。
固體發(fā)酵 納豆激酶的固體發(fā)酵是以大豆為原料,浸泡過夜后經(jīng)過蒸煮,待其冷卻后拌入菌種發(fā)酵形成的。 固態(tài)發(fā)酵所使用的生產(chǎn)設(shè)備簡單,控制方便,發(fā)酵原料成本較低。固態(tài)發(fā)酵是制作納豆激酶的重要生產(chǎn)方式。 但是這個(gè)發(fā)酵方法很難進(jìn)行中間參數(shù)的檢測,因此很難進(jìn)行工藝上的放大生產(chǎn)。
液體發(fā)酵 除了比較傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵,還有液態(tài)發(fā)酵。液體發(fā)酵是以大豆為原料,添加菌種進(jìn)入培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。 在液態(tài)發(fā)酵中比固態(tài)發(fā)酵具有傳質(zhì)均勻,發(fā)酵過程中檢測技術(shù)成熟、可控,能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化和工藝易于放大化等優(yōu)勢,在大規(guī)模生產(chǎn)中液態(tài)發(fā)酵是主要的方法。 微膠囊固定化培養(yǎng)技術(shù)也被應(yīng)用到納豆激酶的液體發(fā)酵過程中,這個(gè)方法能使在發(fā)酵過程中生產(chǎn)出的納豆激酶累積在膠囊中,有利于后續(xù)的分離工序。
分離純化 納豆激酶是胞外酶,將其發(fā)酵液通過一系列分離純化處理后即可得到納豆激酶,納豆激酶的分離純化技術(shù)方法多采用蛋白質(zhì)分離技術(shù)。因發(fā)酵液中的納豆激酶不穩(wěn)定,可能會(huì)在高溫或者過酸過堿中失去活性,所以在選擇 純化方法上很重要,一般常用到的分離純化方法有柱層析法、超濾法、萃取法,膨脹床分離法等。
柱層析法 柱層析法通常要先進(jìn)行 硫酸銨 或有機(jī)溶劑沉淀、過濾或離心、透析等,然后進(jìn)行色譜分析,最后的濾液再進(jìn)行濃縮、冷凍干燥。柱層析法在納豆激酶的分離純化方面被廣泛應(yīng)用,雖然這個(gè)方法的回收率很高但是成本高,操作復(fù)雜,分離時(shí)間過長不利于進(jìn)行工藝的放大生產(chǎn)。
超濾法 超濾法就是將發(fā)酵液通過具有微小孔徑的超濾膜,大分子被孔徑截留下來,小分子則通過濾膜,從而達(dá)到濃縮大分子的作用。雖然這種方法不會(huì)破壞納豆激酶的活性,但是純度不是很高,因此這個(gè)方法要與其他方法一起聯(lián)合使用,比如將超濾法和柱層析法聯(lián)合使用可以獲得活性很高、回收率有很高的納豆激酶。
萃取法 傳統(tǒng)的萃取法用到的有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)的活性,所以在萃取像納豆激酶這類蛋白質(zhì)通常會(huì)采用雙水相萃取法或者反膠團(tuán)萃取法。雙水相萃取利用生物大分子在兩相之間的溶解度不同將納豆激酶分離出來,這個(gè)方法能耗低不會(huì)對環(huán)境造成污染,也能進(jìn)行工藝上的放大生產(chǎn)。反膠團(tuán)萃取法是將表面活性劑中加入非極性溶液,是表面活性分子形成外部疏水、內(nèi)部親水的微球,這些微球?qū)⒓{豆激酶牢牢的包裹在里面,充分的使納豆激酶不與有機(jī)溶劑接觸,使其蛋白活性不會(huì)被破壞,這些微球在進(jìn)入水相后納豆激酶就會(huì)被釋放出來,這個(gè)方法相比傳統(tǒng)的萃取方法選擇性高,成本低,操作也很簡單。
膨脹床分離法 膨脹床分離法是一種集成化分離技術(shù),可以直接從發(fā)酵液中吸附納豆激酶,將納豆激酶濃縮分離純化到一個(gè)單元操作中,避免了納豆激酶在復(fù)雜的純化過程中會(huì)造成酶失活的可能性,提高了產(chǎn)品的回收率,體現(xiàn)了快速分離純化的優(yōu)點(diǎn)。
應(yīng)用領(lǐng)域
醫(yī)藥領(lǐng)域 納豆激酶可以通過作為補(bǔ)充劑添加在藥品中用來降血栓或者預(yù)防疾病的發(fā)生。
納豆激酶納豆激酶作為功能性產(chǎn)品主要以膠囊,片劑,粉劑,液體劑的形式出現(xiàn)在市場上,如凈血酶納豆膠囊、納豆素膠囊和納豆激酶膠囊等,其主要是作為保健品來食用,調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫系統(tǒng),改善血液循環(huán),還可以預(yù)防心血管性疾病。 目前國際規(guī)定納豆激酶制劑的含量單位為FU/片,“FU”是 日本納豆激酶協(xié)會(huì) 對于溶解血栓酵素所定義的一種活性單位,有叫作血栓纖維蛋白溶解率。 納豆激酶在日本現(xiàn)在已有十多家大公司已經(jīng)生產(chǎn)出多種關(guān)于納豆激酶的產(chǎn)品,如大和制藥的NKCP(精制 納豆菌 培養(yǎng)物)已經(jīng)上市。
食品領(lǐng)域 納豆激酶還可以作為食品添加劑來滿足人體對納豆激酶的需求。通過冷凍干燥成為一種天然調(diào)味粉,納豆激酶在經(jīng)過冷凍干燥的操作后能保證原有的營養(yǎng)物質(zhì)不會(huì)被流失,常見產(chǎn)品有凍干納豆菌粉(納豆激酶)。 歐洲食品安全局 在2016年推薦納豆激酶作為食物補(bǔ)充劑,建議最大的攝入量為100mg/d(2000-2800FU/D)。
安全事宜 納豆激酶不具有毒性。