內(nèi)含子
一類新的可動(dòng)因子即第一類內(nèi)含子(groupIintron)已被發(fā)現(xiàn),它們廣泛在于各種生物的線粒體、葉綠體及基因組內(nèi),內(nèi)含子移動(dòng)分內(nèi)含子回歸(intronloss)和內(nèi)含子轉(zhuǎn)座(imtrontransposition),前者已為實(shí)驗(yàn)證實(shí),后者則尚未被證實(shí)。一、第一類內(nèi)含子可動(dòng)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和被步研究
1975年,人們以啤酒酵母菌mt-DNA某些突變?yōu)闃?biāo)記進(jìn)W+XW-雜交,發(fā)現(xiàn)W+傳遞到了代的比例為95%而W-幾乎為零,現(xiàn)象上好似發(fā)生了單方賂基因轉(zhuǎn)變(unidirectionalgeneconversion)。從W-到W+,由于W+中有內(nèi)含子ScLDU.1,而W-則無(wú),故人們認(rèn)為上述現(xiàn)象與該內(nèi)含了有關(guān)。順序分析發(fā)現(xiàn)該內(nèi)含子中存在一個(gè)可讀框PRF,起始于AUG,共長(zhǎng)235個(gè)密碼子,為確定該產(chǎn)物的生化功能,人們以內(nèi)含子上下游的一些富含GC的順序作為探針來(lái)研究W+XW-雜交中兩不同階段的mtDNA,即:(1)合子剛形成時(shí)的mt-DNA,此時(shí)雙親的mt-DNA同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中;(2)幾個(gè)細(xì)胞世代以后,當(dāng)細(xì)胞是同質(zhì)體時(shí)的mt-DNA。通過(guò)對(duì)W+XW-的子代中的同質(zhì)體克隆的觀察發(fā)現(xiàn),內(nèi)含子ScLSU.在子代中的傳遞效率高達(dá)95%,恰好與W+情況相吻合,而mt-DNA上遠(yuǎn)離ScLSU.內(nèi)含子發(fā)生了單方向基因轉(zhuǎn)變,而且在單方向基因轉(zhuǎn)變同時(shí)還發(fā)生距該內(nèi)含子上下游幾百bp范圍的側(cè)翼DNA順序的共轉(zhuǎn)變,其頻率隨距內(nèi)含子的距離的增加而減小。 而當(dāng)研究W+XW-中的合子剛形成時(shí)的mt-DNA時(shí),發(fā)現(xiàn)在無(wú)內(nèi)含子(intronless)LSU基因的內(nèi)含子插入位發(fā)生一個(gè)雙鏈斷裂,該斷裂將隨合子的長(zhǎng)大而消失,推測(cè)與內(nèi)含子插入引起的DNA修復(fù)有關(guān)。同時(shí),當(dāng)Wd突變體和無(wú)內(nèi)含子的野生型雜交時(shí),發(fā)現(xiàn)沒(méi)有內(nèi)含子的單方向基因轉(zhuǎn)變發(fā)生,核苷酸順序分析表明Wd突變?cè)蚴窃趦?nèi)含子ORF的不同位置發(fā)生了移碼突變、無(wú)義突變和多個(gè)堿基置換,說(shuō)明該內(nèi)含子的翻譯產(chǎn)物在I-(intronless)基因的雙鏈斷裂形成中起著直接或間接的作用,1986所有人用通用遺傳密碼構(gòu)建了一個(gè)等同于ScLSU.1內(nèi)含子ORF的順序,發(fā)現(xiàn)它在E.coli中能表達(dá)為一個(gè)內(nèi)切核酸酶,并可高度特異地切割帶內(nèi)含子切割序的mt-DNA,該識(shí)別順序共長(zhǎng)18bp,切割后可產(chǎn)生4bp伸出的3'-OH末端以插入內(nèi)含子,而內(nèi)含子一旦插入到無(wú)內(nèi)含子順序后,該順序就被分割成兩部分,無(wú)法再為內(nèi)切核酸酶識(shí)別,從而可陰止I+基因的自切割,使基因變均表現(xiàn)為單方向的,即從I+到I-。通過(guò)對(duì)酵母W系統(tǒng)的研究可概括出第一類內(nèi)含子可動(dòng)的三個(gè)條件: (1)一個(gè)基因的兩種功能形式的存在,即I+和I-,且能通過(guò)雜交進(jìn)行遺傳交換;
(2)在內(nèi)含子中要存在一咱ORF,并編碼有功能的雙鏈內(nèi)切核酸酶;
(3)在無(wú)內(nèi)含子基因中存在呆為該內(nèi)切梳酸酶識(shí)別的順序。
在W系統(tǒng)研究之后,人們通過(guò)許多雜交實(shí)驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)了一系列可動(dòng)的第一類內(nèi)含子,例Chlamydomonaseugametos的cp-DNA中的CeLSU.5、Saccharomycescererisiae中的Sccox1.4,T4噬菌體中的T4td.1和T4aunY.1,Physarumpolycephalum的PpLSU.3及Neurosporacrassa中的含子Ncnd1,1等。 內(nèi)含子和 外顯子
二、第一類內(nèi)含子可動(dòng)的可能機(jī)制第一類內(nèi)含了DNA的內(nèi)部ORF表達(dá),產(chǎn)生一個(gè)雙鏈內(nèi)切核酸酶,該酶識(shí)別無(wú)內(nèi)含子的同一基因上的順序并結(jié)合上去,酶切產(chǎn)生具有4bp伸出析3'-OH末端的雙鏈斷裂,然后以I+基因的未切割的同源順序作為模板來(lái)修復(fù)雙鏈斷裂,該修復(fù)機(jī)制延伸到側(cè)翼區(qū)域,導(dǎo)致共轉(zhuǎn)變,而內(nèi)含子一旦插入后,它本身既可產(chǎn)生內(nèi)切核酸酶,也可作為修復(fù)斷裂的模板,從而使整個(gè)過(guò)程可不斷進(jìn)行。
內(nèi)含子轉(zhuǎn)座也通過(guò)相同的過(guò)程進(jìn)行,由于內(nèi)切核酸酶識(shí)別順序可存在于三種位置:(1)同一基因的拷則;(2)不同基因;(3)基因間區(qū)域,這三種情況下的內(nèi)含子插入,導(dǎo)致三種不同結(jié)果,第一種情況在內(nèi)含子插入后產(chǎn)生內(nèi)含子回歸;第二種導(dǎo)致轉(zhuǎn)座,因?yàn)椴迦胄挛稽c(diǎn)的內(nèi)含子進(jìn)行有效的RNA剪接;第三種情況也導(dǎo)致轉(zhuǎn)座,但由于插入的內(nèi)含子DNA無(wú)法轉(zhuǎn)錄,故它將經(jīng)隨機(jī)突變而消失。同時(shí),在雙鏈斷裂的修復(fù)中,切點(diǎn)周圍的順序和未切割模板的外顯順序之間的同源性對(duì)修復(fù)亦很重要,同源性越高,修復(fù)效率越高。所以,內(nèi)含子回歸很常見(jiàn),而內(nèi)含子轉(zhuǎn)座則很少見(jiàn)。 另處,內(nèi)含子轉(zhuǎn)座也可通過(guò)RNA中介進(jìn)行,基因Gl(I+)經(jīng)轉(zhuǎn)錄和自剪接產(chǎn)生被切下來(lái)的內(nèi)含子RNA,該RNA通過(guò)反向剪接整合到另一個(gè)基因G2(I-)中,再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和重組,產(chǎn)生帶有I的G2,這種情況主要是在四膜蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的。 內(nèi)含子
三、第一類內(nèi)含子可動(dòng)現(xiàn)象的作用和意義內(nèi)含子DNA順序插入到一個(gè)新位置,應(yīng)帶來(lái)它的轉(zhuǎn)錄和剪接問(wèn)題,內(nèi)含子回歸不存在這個(gè)問(wèn)題,因?yàn)镮+基因本身可正常轉(zhuǎn)錄和剪接。但是,就內(nèi)含子轉(zhuǎn)坐而言,由于內(nèi)含子本身無(wú)啟動(dòng)子,其轉(zhuǎn)坐有賴于宿主基因,所以,內(nèi)含子轉(zhuǎn)座常導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)無(wú)活性的內(nèi)含子,它將因無(wú)法時(shí)行有效轉(zhuǎn)錄而通過(guò)隨機(jī)突變?cè)谶M(jìn)化中消失,故內(nèi)含子轉(zhuǎn)座的頻率很低。
同時(shí),當(dāng)內(nèi)含子插入到某一基因后,要保持該基因的正常功能,就必須有效的進(jìn)行RNA剪接,第一類內(nèi)含子的剪接和內(nèi)含子的IGS(internalguidesequence)順序與上游外顯子之間堿基配對(duì)的相互作用有關(guān),故一個(gè)成功的內(nèi)含子插入依賴于該內(nèi)含子能夠與新的基因相匹配。同時(shí),資料表明,許多第一類內(nèi)含子的上游外顯子有短的保留下游外顯子沒(méi)有,故推測(cè)可能內(nèi)含子發(fā)生轉(zhuǎn)座后,可通過(guò)隨機(jī)突變或特異的復(fù)制機(jī)來(lái)適應(yīng)新的回歸位點(diǎn),以獲得與外顯子的正確匹配,從而成為一個(gè)成功的內(nèi)含子轉(zhuǎn)座,當(dāng)然,轉(zhuǎn)座中外顯子的共轉(zhuǎn)變或外顯子通過(guò)隨機(jī)突變而適應(yīng)新插入的內(nèi)含子兩種方式同樣也能提高內(nèi)含子和外顯子的匹配,提高內(nèi)含子轉(zhuǎn)座的成功率。 既然單方向內(nèi)含子插入的頻率及高,I-等位基因?yàn)楹挝丛谌后w中消失呢?一種解釋是:I+基因是近期出現(xiàn)的,并將隨時(shí)間推移取代所有I-等位基因;另一種解釋認(rèn)為是自然不利于含有內(nèi)含子的細(xì)胞的生長(zhǎng);而目前更多的人認(rèn)為是內(nèi)含子回歸和丟失之間的平衡維持第一類內(nèi)含在細(xì)胞世代穩(wěn)定存在,只要插入到合適的位置后能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄和剪接,同時(shí)不給細(xì)胞帶來(lái)任何新的表型。在S.cerevisiae中,mt-內(nèi)含子的剪接功能缺陷型是呼吸缺陷的,而這些內(nèi)含子發(fā)生缺失后就可得到呼吸正常的野生型表型的回復(fù)子,故人們推測(cè)內(nèi)含子丟失的可能機(jī)制是:I+RNA發(fā)生剪接,除去內(nèi)含子,再反轉(zhuǎn)錄,并通過(guò)受體基因和cDNA外顯子順序之間的同源重組,導(dǎo)致內(nèi)含子丟失,而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)第二類內(nèi)含子和反轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶有同源順序, 使人們猜想第一類內(nèi)含子的丟失可能由第二類內(nèi)含子的翻譯產(chǎn)物控制,1989年有人用mss18突變體證明了這一想法,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)表明,第一類內(nèi)含子Secoxl.5b的發(fā)生缺失需要第二類內(nèi)含子Sccoxl.1Sccoxl.2的存在。
目前對(duì)大量的生物研究表明,大批內(nèi)含子在生物中的分布物不均衡,表示為(1)同一種的不同個(gè)體中,有的有內(nèi)含子,有的沒(méi)有;(2)同一基因在不同種生物基因組中的內(nèi)含子的特性,數(shù)目位置等不同,如Sccoxl.2b和Ancoxl.3是高度同源內(nèi)含子插入在不同種的同一回歸位點(diǎn)的例子,這兩種內(nèi)含子有70%順序相同,但內(nèi)含子周圍的外顯子順序很不同,從而推測(cè)可能是內(nèi)含子發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果,而不同生物不同回歸位點(diǎn)有高度同源內(nèi)含子存在的事實(shí),如ScLSU.1和Nccob.2也說(shuō)明水平轉(zhuǎn)移的可能??傊?,內(nèi)含子在不同種或同一種的不同個(gè)體中的不同回歸位點(diǎn)分布的不均可以用內(nèi)含子回歸和內(nèi)含子丟失之間的平衡來(lái)解釋,而在不回歸位點(diǎn)分布的不均可以用回歸的內(nèi)含子丟失之間的平衡來(lái)解釋,而在不同回歸位點(diǎn)上相似相關(guān)內(nèi)含子的存在則可能是內(nèi)含子轉(zhuǎn)座的結(jié)果。而且,如果這種內(nèi)含子轉(zhuǎn)座是發(fā)生在極其不同的種之間的話,那么,可能在轉(zhuǎn)移過(guò)程中還存在著某種未知形式的分子載體。當(dāng)然,這還只是一種設(shè)想,有待于進(jìn)一步的證實(shí)。