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毛細管電泳法
以高壓直流電場為驅(qū)動力的技術(shù)
基本信息
| 中文名 | 毛細管電泳法 |
| 外文名 | capillary electrophoresis |
| 特點 | 應(yīng)用廣泛、高效、快速、微量 |
毛細管電泳
所用設(shè)備
主要部件有0～30kV可調(diào)穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，內(nèi)徑小于100μm(常用50～75μm)、長度一般為30～100cm的石英毛細管、電極槽、檢測器和進樣裝置。檢測器有紫外/可見分光檢測器、激光誘導(dǎo)熒光檢測器和電化學(xué)檢測器，前者最為常用。進樣方法有電動法(電遷移)、壓力法(正壓力、負壓力)和虹吸法。成套儀器還配有自動沖洗、自動進樣、溫度控制、數(shù)據(jù)采集和處理等部件。
分離模式
最常見的模式，用以分析帶電溶質(zhì)。樣品中各個組分因為遷移率不同而分成不同的區(qū)帶。為了降低電滲流和吸附現(xiàn)象，可將毛細管內(nèi)壁做化學(xué)修飾。
毛細管凝膠電泳，在毛細管中裝入單體，引發(fā)聚合形成凝膠，主要用于測定蛋白質(zhì)、DNA等大分子化合物。另有將聚合物溶液等具有篩分作用的物質(zhì)，如葡聚糖、聚環(huán)氧乙烷，裝入毛細管中進行分析，稱毛細管無膠篩分電泳，故有時將此種模式總稱為毛細管篩分電泳，下分為凝膠和無膠篩分兩類。
膠束電動毛細管色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉，形成膠束，被分離物質(zhì)在水相和膠束相(準固定相)之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細管內(nèi)遷移，達到分離。本模式能用于中性物質(zhì)的分離。
親和毛細管電泳，在毛細管內(nèi)壁涂布或在凝膠中加入親和配基，以親和力的不同達到分離目的。
毛細管電色譜，是將HPLC的固定相填充到毛細管中或在毛細管內(nèi)壁涂布固定相，以電滲流為流動相驅(qū)動力的色譜過程，此模式兼具電泳和液相色譜的分離機制。
毛細管等電聚焦電泳，是通過內(nèi)壁涂層使電滲流減到最小，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進樣，兩個電極槽中分別為酸和堿，加高電壓后，在毛細管內(nèi)建立了pH梯度，溶質(zhì)在毛細管中遷移至各自的等電點，形成明顯區(qū)帶，聚焦后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值使溶質(zhì)通過檢測器。
毛細管等速電泳，采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì)，使溶質(zhì)按其電泳倘度不同得以分離。
以上各模式以CZE、CGE、MECE三種應(yīng)用較多。
對儀器的要求
所用的儀器為毛細管電泳儀。正文中凡采用毛細管電泳法測定的品種，其所規(guī)定的測定參數(shù)，除分析模式、檢測方法(如紫外光吸收或熒光檢測器的波長、電化學(xué)檢測器的外加電位等)應(yīng)按照該品種項下的規(guī)定外，其他參數(shù)如毛細管內(nèi)徑、長度、緩沖液的pH值、濃度、改性劑添加量、運行電壓或電流的大小、運行的時間長短、毛細管的溫度等，均可參考該品種項下規(guī)定的數(shù)據(jù)，根據(jù)所用儀器的條件和預(yù)試驗的結(jié)果，進行必要的調(diào)整。
檢測方法
毛細管電泳通常用到的檢測方法有吸收光譜，熒光光譜，熱鏡，拉曼光譜，質(zhì)譜和電化學(xué)方法。
分離系統(tǒng)
毛細管電泳
近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，在蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸(DNA)等生物大分子的分離分析中表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)越性。20世紀90年代初，Manz和Widmer等首次提出了以微機電加工技術(shù)(microelectromechanical systems，MEMS)和分析化學(xué)為基礎(chǔ)的微全分析系統(tǒng)(miniaturized total analysis systems，mTAS)的概念。當(dāng)前，隨著蛋白質(zhì)組研究的深入和發(fā)展，如何實現(xiàn)蛋白質(zhì)快速高效的分離成為需要解決的重要問題。在芯片上進行蛋白質(zhì)的毛細管電泳分離可以顯著地提高分析速度和分離效率，因此，這一研究方向引起了廣泛關(guān)注，已有較多論文發(fā)表。
特點
芯片毛細管電泳技術(shù)將常規(guī)的毛細管電泳操作在芯片上進行，利用玻璃、石英或各種聚合物材料加工微米級通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，對樣品進行進樣、分離及檢測。它與常規(guī)毛細管電泳的分離原理相同，因此在分離生物大分子樣品方面具有優(yōu)勢。此外，與常規(guī)毛細管電泳系統(tǒng)相比，芯片毛細管電泳系統(tǒng)還具備分離時間短、分離效率高、系統(tǒng)體積小且易實現(xiàn)不同操作單元的集成等優(yōu)點。芯片毛細管電泳的上述優(yōu)點使其成為蛋白質(zhì)分離分析中的重要手段之一。Rodriguez等曾分別在常規(guī)毛細管、短毛細管和玻璃芯片上，以區(qū)帶電泳的分離模式，對人免疫球蛋白G(IgG)和熒光素異硫氰酸酯(FITC)的反應(yīng)混合物進行分離，以比較3種系統(tǒng)的分離性能。使用有效分離長度為35 am的長毛細管和有效分離長度為6 am的短毛細管時，其分離時間分別為335 S和84 S，理論塔板數(shù)分別為27 750和41 816。當(dāng)使用有效分離長度僅為2．8 cm的玻璃芯片時，分離時間縮短至15 S，理論塔板數(shù)達到49 000。由此可以看出采用玻璃芯片進行毛細管區(qū)帶電泳在分離速度和柱效上明顯優(yōu)于常規(guī)毛細管電泳系統(tǒng)。
模式
芯片毛細管區(qū)電泳
毛細管區(qū)帶電泳是芯片毛細管電泳分離蛋白質(zhì)的一種最基本的分離模式。它基于不同的蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移速率不同而實現(xiàn)分離，是一種簡單、快速的分離方法。采用區(qū)帶電泳分離模式已成功地分離了多種蛋白質(zhì)樣品。
Colyer等采用毛細管電泳芯片，以區(qū)帶電泳模式對人血清蛋白樣品進行了分離，可分辨出4個蛋白質(zhì)區(qū)帶(即IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、a-1-抗胰蛋白酶和白蛋白區(qū)帶，分別用以模擬血清蛋白樣品中的7、p、dl和白蛋白區(qū)帶)。其中蛋白質(zhì)的熒光標記在分離之后進行，由于熒光染料TNS(2-toluidinonaphtha．1-ene-5-sulfonate)標記血清蛋白的靈敏度較低，所以沒能實現(xiàn)實際人血清蛋白樣品的5個區(qū)帶分離。Xiao等采用區(qū)帶電泳模式，以50 mmoVL磷酸鹽緩沖液(pH 2．15)作為工作緩沖液，在通道寬度為30um的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片中，于35s內(nèi)實現(xiàn)了細胞色素C和溶菌酶的快速分離。Dodge等設(shè)計了集成8個微閥和1個微泵的PDMS芯片，通過微閥微泵實現(xiàn)了對液流的有效控制。他們首先采用區(qū)帶電泳的分離模式分離牛血清白蛋白和肌紅蛋白，然后通過閥的作用將分離后的蛋白質(zhì)組分分別引入微混合器中酶解，最后對產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析。該工作顯示芯片技術(shù)可用于質(zhì)譜分析前復(fù)雜蛋白樣品的預(yù)處理。莊等在石英芯片上以75 mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 10．3)作為芯片電泳緩沖體系，分離了免疫球蛋白、O/一1一抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和鐵傳遞蛋白，并對經(jīng)臨床確診的妊娠高血壓癥、風(fēng)濕性心臟病、多發(fā)性骨髓瘤患者的尿液樣品進行電泳分析，在2 min內(nèi)得到了與美國Helena電泳系統(tǒng)一致的分析結(jié)果。
在芯片毛細管電泳分離蛋白質(zhì)的研究中所要解決的一個重要問題就是通道表面對大分子蛋白質(zhì)的吸附問題。蛋白質(zhì)與芯片通道內(nèi)壁之問的微小吸附效應(yīng)就會降低蛋白質(zhì)的分離效率，引起峰形變寬拖尾，影響分離的重現(xiàn)性。在毛細管區(qū)帶電泳分離模式下，一般采用通道內(nèi)壁永久改性和緩沖液中加入添加劑進行動態(tài)修飾兩種方法來抑制蛋白質(zhì)的吸附。
Wu等采用多層88%水解聚丙烯醇(PVA)修飾PDMS芯片，以區(qū)帶電泳模式有效分離了兩種堿性蛋白質(zhì)(溶菌酶和核糖核酸酶)以及兩種典型的酸性蛋白質(zhì)(牛血清白蛋白和口．乳球蛋白)。該涂層在pH 3～11范圍內(nèi)均可抑制電滲流的產(chǎn)生和蛋白的吸附作用，并且效果穩(wěn)定，連續(xù)運行70次后分離效果仍然很好。該研究組隨后又采用自組裝方法在PDMS芯片通道表面加工環(huán)氧修飾的聚合物涂層抑制蛋白質(zhì)的吸附，成功地分離了溶菌酶和核糖核酸酶A。Chiem等在運行緩沖液中加入了無機電解質(zhì)NaCl和中性表面活性劑吐溫20來抑制蛋白質(zhì)的吸附，利用芯片毛細管區(qū)帶電泳進行了單克隆抗體的分離分析。 ‘
凝膠電泳
在蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)分離研究中，凝膠電泳是廣泛使用的分離技術(shù)。它是以凝膠等聚合物作為分離介質(zhì)，利用其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并依據(jù)被測組分的分子體積不同而進行分離的一種分離模式。在芯片上采用凝膠電泳模式分離蛋白質(zhì)，更有利于實現(xiàn)分離操作的高速度和高效率。Yao等采用十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳分離模式，對比了芯片SDS毛細管凝膠電泳與常規(guī)毛細管凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的性能，結(jié)果表明前者的分離效率明顯優(yōu)于后者，分離時間也明顯低于后者。
與常規(guī)毛細管凝膠電泳相同，芯片毛細管凝膠電泳常用的篩分介質(zhì)也分為凝膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介質(zhì)，Herr等首次將傳統(tǒng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS·PAGE)分離蛋白質(zhì)的方法移植到芯片上，采用光聚合的方法在芯片通道內(nèi)制備濃度為6%的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)，在30S的時間內(nèi)對相對分子質(zhì)量(M，)在5 500～39 000之問的5種蛋白質(zhì)進行分離，分離距離僅為4 mm，分離效率達到理論塔板數(shù)4．41×105。該研究組’1引后期又在微通道內(nèi)制備了濃度為22%的交聯(lián)聚丙烯酰胺膜用于蛋白質(zhì)樣品的預(yù)富集，有效富集了相對分子質(zhì)量為12 000～205 000的蛋白質(zhì)分子，并采用濃度為8%的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)進行分離。
Agirregabiria等在聚甲基丙烯酸甲酯(PM—MA)芯片上使用SU一8光膠制作微通道，采用濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)分離蛋白質(zhì)。隨后該研究組又在該芯片上集成金屬電極，采用相同的分離模式成功地分離了相對分子質(zhì)量分別為20 000和97 000的胰蛋白酶抑制劑和磷酸化酶兩種蛋白質(zhì)。然而，交聯(lián)聚阿烯酰胺凝膠存在制備復(fù)雜、不易使用等問題。與其相比，線性聚丙烯酰胺(PLA)、聚乙烯醇(PEG)、聚氧化乙烯(PEO)等非膠篩分介質(zhì)具有制備簡單、使用方便、可以先聚合后注入通道而無需在通道內(nèi)進行聚合反應(yīng)等優(yōu)點，適合在復(fù)雜的通道體系中使用，因此在芯片毛細管凝膠電泳中非膠篩分介質(zhì)得到了廣泛的應(yīng)用。Yao等采用SDS 14·200凝膠緩沖液(Beckman Coulter公司產(chǎn)品)在玻璃芯片上于35 s內(nèi)分離了相對分子質(zhì)量在9 000～l 16 000之間的6種蛋白質(zhì)。Giordano等將NanoOrange染料加入樣品和緩沖液中進行蛋白質(zhì)的動態(tài)標記，并對分離緩沖液體系進行了優(yōu)化，最終選擇5%的PEO(M，=100 000)作為篩分介質(zhì)。該系統(tǒng)對牛血清白蛋白的檢出限為500ng/mL，并完成了對實際人血清樣品的分離分析。
在芯片毛細管凝膠電泳中，通道內(nèi)壁對蛋白質(zhì)的吸附仍是需要解決的重要問題。Bousse等使用聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)物理涂覆玻璃芯片微通道內(nèi)壁，將電滲流降低到0．5×10～m zV s ．以SDS凝膠電泳的分離模式在40 s內(nèi)分離了Bio—Rad公司的蛋白質(zhì)標準樣品’，分離效率達到107塔板/m。Nagata等在PMMA芯片中使用了PEG涂層，以5%線性聚丙烯酰胺為篩分介質(zhì)，在分離長度為3 mm的通道內(nèi)實現(xiàn)了胰蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白和盧半乳糖苷酶3種蛋白質(zhì)的高速分離，分離時間僅為8 S。
芯片等電聚焦分離
芯片等電聚焦分離蛋白質(zhì)的原理與常規(guī)毛細管等電聚焦基本相同，都是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(pI)不同而進行分離。Hofmann等首次將毛細管等應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析。
Li等在PDMS芯片和聚碳酸酯(PC)芯片上，采用等電聚焦模式分離廠牛血清白蛋白和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)。Das等。26 3采用高聚物芯片，在等電聚焦電泳模式下優(yōu)化了，分離長度及電壓條件，最終在長1．9 cm的通道內(nèi)于1．5 min內(nèi)分離了綠熒光蛋白和R藻紅蛋白，分離電壓為500 V。Cui等在PDMS芯片上采用等電聚焦分離模式成功分離了組綠熒光蛋白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。該作者還報道，通過改變樣品和分離介質(zhì)中添加劑甲基纖維素的濃度，可以改變完成蛋白質(zhì)分離所需要的通道距離，Tsai等通過采用六甲基二硅氧烷等離子聚合膜修飾玻璃芯片通道的方法抑制蛋白質(zhì)吸附，在等電聚焦的分離模式下分離了藻青蛋白(pI：4·65)、血紅蛋白(pI: 7．0)和細胞色素C(pI：9·6)3種蛋白質(zhì)混合物，分離在3 min內(nèi)完成，分離效率為19 600塔板/m。Huang等在進行芯片等電聚焦分離蛋白質(zhì)時，采用在兩性電解質(zhì)溶液中加入羥甲基纖維素作為添加劑的方法來抑制蛋白質(zhì)的吸附。
電動毛細管電泳
膠束電動毛細管電泳是毛細管電泳與膠束增溶色譜相結(jié)合的分離技術(shù)，其原理是在裝有膠束溶液的通道內(nèi)，溶質(zhì)組分在電場力的作用下根據(jù)其在膠束相和水相之問的分配不同而產(chǎn)生分離。Jin等在玻璃芯片上采用膠束電動色譜的分離模式，以Bio-Rad公司的CE·SDS緩沖液作為分離介質(zhì)，成功實現(xiàn)了相對分子質(zhì)量在14 400～200 000之間的8種蛋白質(zhì)的分離。Dou等采用Brij35(polyoxyethylene[23]dodecan01)修飾PDMS芯片通道，在膠束電動色譜的分離模式下實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離。該芯片涂層在pH 2～6范圍內(nèi)可顯著降低蛋白質(zhì)大分子的吸附，并減少檢測蛋白質(zhì)所需的沖洗時間，從而提高分離效率。Huang等在PDMS芯片中采用0．1%十二烷基麥芽糖(DDM)和0．03%SDS作為混合膠束，對通道進行動態(tài)修飾，有效地抑制了蛋白質(zhì)的吸附，控制了電滲流，使蛋白質(zhì)在非變性條件下得到有效分離．
芯片二維電泳分離
芯片毛細管電泳應(yīng)用的成功促進了高速高效的芯片二維電泳技術(shù)的發(fā)展。對于多組分的復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品，采用傳統(tǒng)的一維分離方法通常無法滿足要求，需要采用二維分離技術(shù)來提高分離效率，增加峰容量。與傳統(tǒng)的毛細管電泳系統(tǒng)相比，在芯片上進行二維電泳分離，可以通過設(shè)計芯片通道結(jié)構(gòu)實現(xiàn)通道的直接交叉或連通，而無需制作復(fù)雜的二維毛細管電泳接口，從而避免了因在接口處存在死體積而導(dǎo)致的譜帶擴展現(xiàn)象。
在芯片二維電泳分離蛋白質(zhì)的研究中，第一維分離模式多采用等電聚焦模式。Chen等制作了二維毛細管電泳PDMS芯片，利用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對熒光標記的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科薩斯紅標記的卵清蛋白進行分離分析。Li等設(shè)計了等電聚焦和凝膠電泳聯(lián)用的二維分離高聚物心4t-片。蛋白質(zhì)樣品在完成第一維的等電聚焦分離后，可在多個并行的通道內(nèi)完成第二維的凝膠電泳分離。整個分離過程在10 min內(nèi)完成，峰容量達到1 700。Herr等：”1研制r采用十字通道構(gòu)型的等電聚焦一自由區(qū)帶電泳二維芯片系統(tǒng)，芯片通道寬200斗m，深20斗m，待測樣品在橫向通道中進行等電聚焦分離，分離后的樣品區(qū)帶在電場驅(qū)動下進入縱向區(qū)帶電泳通道中進行第二維分離。系統(tǒng)采用熒光顯微鏡成像的方法對分離性能進行了評價，5 min內(nèi)分離的峰容量達到1 300。Wang等通過在PDMS芯片中制作微閥來防止一維等電聚焦和二維凝膠電泳系統(tǒng)之間的分離緩沖液相混合，在20 rain內(nèi)有效分離了4種標準蛋白質(zhì)。也有報道在PMMA芯片上進行SDS凝膠電泳和膠束電動毛細管電泳相結(jié)合的蛋白質(zhì)二維電泳分離。該系統(tǒng)在12 min內(nèi)完成10種蛋白質(zhì)的分離，峰容量約為l 000。
此外，還有一類基于芯片的二維分離系統(tǒng)主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解物的分離分析。通常第一維分離采用膠束電動毛細管電泳或毛細管電色譜模式，第二維分離采用區(qū)帶電泳模式2000年，Ramsey課題組?！?首次在玻璃芯片上建立了膠束電動毛細管電泳(第一維)與區(qū)帶電泳(第二維)結(jié)合的二維分離系統(tǒng)，并應(yīng)用于細胞色素C、核糖核酸酶、d哥L白蛋白等的胰蛋白酶降解產(chǎn)物分離。其后，該課題組對系統(tǒng)進行了改進，加長了第一維電泳通道的長度，并采用細徑轉(zhuǎn)角通道來降低擴散，在約15 min內(nèi)分離了牛血清白蛋白酶解物，峰容量達到4 200。2001年，他們還研制了開管電色譜和區(qū)帶電泳相結(jié)合的芯片二維電泳系統(tǒng)，其電色譜分離部分采用長25 cm的具有十八烷基三甲氧基硅烷涂層的環(huán)狀通道，區(qū)帶電泳部分則采用長1．2 am的直形通道，在13 min內(nèi)實現(xiàn)了屆一酪蛋白胰蛋白酶解產(chǎn)物的分離。
相對于一維分離芯片，二維芯片分離系統(tǒng)具有很高的分離效率和峰容量，預(yù)計會在復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離上發(fā)揮更大的作用。
芯片自由流電泳
除上述分離模式外，芯片自由流電泳也是芯片電泳分離蛋白質(zhì)的重要方法。芯片自由流電泳是指在芯片中通過外加電場使樣品隨緩沖液連續(xù)流動的同時沿電場方向進行電遷移，從而按照電泳淌度不同實現(xiàn)分離的電泳分離模式。Raymond等采用芯片自由流電泳模式分離了人血清蛋白、緩激肽和核糖核酸酶A，其分離長度為3．1 cm，流出時間為62 S。Kobayashi等采用自由流電泳的分離模式在一個體積為56．5 mm×35 mm×30 mm的微分離室(60uL)中實現(xiàn)了持續(xù)的蛋白質(zhì)分離，并用羥丙基甲基纖維素涂覆來抑制蛋白質(zhì)吸附，在25 min內(nèi)有效分離了細胞色素C和肌紅蛋白。最近，Kohl．heyer等H 3。制作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質(zhì)的玻璃芯片，成功地將人血清白蛋白(pI=4．4)與等電聚焦標記物(pH 3和9)分離。
展望
微流控芯片毛細管電泳系統(tǒng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離分析具有突出的優(yōu)越性，特別是在臨床檢驗及現(xiàn)場監(jiān)測等方面的應(yīng)用具有良好的發(fā)展前景，同時，其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展也具有重要意義。據(jù)文獻報道，Renzi等已經(jīng)研制出手持式的微流控芯片電泳分離蛋白質(zhì)裝置。該裝置由電泳芯片、小型激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)以及高壓電源等組成，其體積僅為11．5 cm×11．5 cm×19．0 cm，可用于現(xiàn)場分析、床旁醫(yī)學(xué)診斷以及取證分析。近年來，國內(nèi)已有關(guān)于利用芯片毛細管電泳進行臨床尿蛋白和脂蛋白檢測的報道。最近，Pandey等”川使用Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白質(zhì)芯片來檢測微量的白蛋白尿，將蛋白質(zhì)的電泳分離和熒光檢測集成化、自動化，實現(xiàn)了其在臨床實驗室的應(yīng)用。
目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究，以進一步提高系統(tǒng)對復(fù)雜樣品的分離分析能力。上述系統(tǒng)在蛋白質(zhì)分離分析及蛋白質(zhì)組研究中有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是對于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的多維分離分析，芯片毛細管電泳以其快速高效的特點，可以作為其中的一維分離方法，顯著提高蛋白質(zhì)的分析通量。相信隨著研究的不斷深入及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控芯片毛細管電泳蛋白質(zhì)分離技術(shù)將日趨成熟，在生化分析、臨床診斷和蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用
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