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抗原修復(fù)
組織在制作過(guò)程中，由于化學(xué)試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過(guò)程中不能將其顯示出來(lái)，為了解決上述的問(wèn)題，利用化學(xué)試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來(lái)或修正過(guò)來(lái)的過(guò)程稱為抗原修復(fù)。
基本信息
| 中文名 | 抗原修復(fù) |
| 所屬領(lǐng)域 | 化學(xué)生物學(xué) |
基本信息
在免疫組化染色后的鏡下觀察中，有發(fā)現(xiàn)這樣的結(jié)果，陽(yáng)性物反應(yīng)不強(qiáng)，時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，表達(dá)不均勻，有時(shí)可出現(xiàn)假陰性，這是因?yàn)椋?/span>
1.組織在用甲醛固定的過(guò)程中所形成的醛鍵可封閉抗原的決定簇。甲醛與組織蛋白質(zhì)類的反應(yīng)是多樣而復(fù)雜的，因?yàn)樗芎投喾N不同的功能基團(tuán)結(jié)合，在多數(shù)情況下在其間形成橋鍵8。這也是甲醛的一個(gè)作用，因?yàn)樗且环N聚合固定劑，因而能在相鄰的蛋白質(zhì)鍵間形成橋鍵的作用。
2. 甲醛在保存進(jìn)程中會(huì)形成羥甲基，也可封閉抗原決定簇。據(jù)French和Edsall的研究認(rèn)為，最常遇到的甲醇反應(yīng)，就是加到一個(gè)含反應(yīng)性氫原子的化合物中，形成一個(gè)羥甲基化合物。
為了解決上述存在的問(wèn)題，更好地暴露出抗原，將其很好地顯示出來(lái)，目前世界上公認(rèn)的方法就是必須進(jìn)行抗原修復(fù)。
至今為止，抗原修復(fù)有許多種方法，在這些方法中，有的是根據(jù)抗體的要求來(lái)進(jìn)行，有的是根據(jù)抗原的表達(dá)程度來(lái)進(jìn)行，我們則對(duì)每種病例每項(xiàng)檢測(cè)，都要求必須進(jìn)行抗原修復(fù)，以達(dá)到抗原全面表達(dá)的最佳狀態(tài)。
物理化學(xué)試劑抗原修復(fù)法
1. 真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：
① 切片脫蠟至水。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
⑤待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
這是一種操作簡(jiǎn)單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點(diǎn)有四：一是各物質(zhì)的分子在失重的情況下四處飄游，增加各分子間的碰撞機(jī)會(huì)；二是有恒定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發(fā)生變性，又不需要使抗原修復(fù)液達(dá)到沸騰，不會(huì)導(dǎo)致切片因抗原修復(fù)液的沸騰而離開載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反復(fù)制片的麻煩，保證了病理報(bào)告的及時(shí)發(fā)生，為病人爭(zhēng)取更多的時(shí)間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進(jìn)行操作；四是可以一次性制作大批的切片。
2.微波輻射抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測(cè)Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。
⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行染色。
該法與上法相比，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬(wàn)次的快速運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生瞬間熱。當(dāng)然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達(dá)到目的。應(yīng)用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質(zhì)分子作極性運(yùn)動(dòng)。促進(jìn)形成的醛鍵斷裂開。分子間運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的瞬間熱，當(dāng)達(dá)到有效的溫度后，就可導(dǎo)致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點(diǎn)是：產(chǎn)熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復(fù)液的沸騰，使用微波爐時(shí)禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。
3.高壓抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。
該法高壓和高熱來(lái)促進(jìn)醛鍵的斷裂，當(dāng)加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時(shí)的溫度已達(dá)121℃左右。該法被應(yīng)用于一些較難修復(fù)的抗原，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，該法效果不錯(cuò)。
4.隔水熱抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計(jì)測(cè)其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度后（92℃↑）。即開始計(jì)時(shí)，持續(xù)40分鐘。
⑤待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
該法應(yīng)用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長(zhǎng)時(shí)間的熱的作用，在早期應(yīng)用于Er和Pr染色的抗原修復(fù)時(shí)，我們的修復(fù)時(shí)間為40分鐘，如果達(dá)不到這時(shí)間，效果將不理想。
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④ 將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，當(dāng)達(dá)92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時(shí)，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。
⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
對(duì)各種抗原修復(fù)方法的評(píng)價(jià)。
該法是在沒(méi)有上述的設(shè)備時(shí)才選用的一種方法，當(dāng)然效果是最差的，因?yàn)樗皇菃慰繜岬淖饔?，這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計(jì)來(lái)測(cè)量溫度，對(duì)其溫度不好控制，有時(shí)需要多次關(guān)閉電源來(lái)維持所需的溫度。
抗原修復(fù)，必須注意以下問(wèn)題
1、PH值的應(yīng)用范圍及選擇。
應(yīng)用于抗原修復(fù)的物質(zhì)很多，但至今為止，大家公認(rèn)的最好的抗原修復(fù)液還是檸檬酸鹽緩沖液PH6.0，據(jù)多年來(lái)的實(shí)踐認(rèn)為，該液確實(shí)很好，它適合于大多數(shù)的抗原，在常規(guī)應(yīng)用的臨床標(biāo)記抗體中基本都適用，經(jīng)用該液修復(fù)后的抗原表達(dá)增強(qiáng)，抗原的定性和定位很理想，結(jié)果不錯(cuò)。但近來(lái)也有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用抗原修復(fù)液PH8.0的效果也不錯(cuò)。
2.抗原修復(fù)時(shí)應(yīng)選擇最佳溫度。
據(jù)Masson等研究表明：70℃－90℃的溫度對(duì)沒(méi)有經(jīng)固定的蛋白可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白，要使其發(fā)生變性，溫度必須在92℃↑。據(jù)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為溫度在92℃－98℃是合適的，尤其在95℃為最好，這是因?yàn)椋孩龠@種溫度未達(dá)沸騰，切片不容易脫離裁片；②能夠解離和破壞與蛋白交聯(lián)的甲醛醛鍵等，處理時(shí)可以隨意選擇和確定抗原修復(fù)的作用時(shí)間。
3.抗原修復(fù)時(shí)有效溫度所需持續(xù)時(shí)間根據(jù)各單位的設(shè)備條件以及使用的儀器不同，抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間也不一樣。例如：真空負(fù)壓抗原修復(fù)法，當(dāng)達(dá)到預(yù)定的溫度和所需的負(fù)壓（66.7KPa）后可持續(xù)5-10分鐘，微波輻射抗原修復(fù)法溫度不好控制，抗原修復(fù)液容易沸騰，如果切片附貼任憑其沸騰持續(xù)5-10分鐘。如果切片附貼很牢固，為了防止脫片，一發(fā)現(xiàn)抗原液已沸騰，即可關(guān)掉電源，待溫度下降后，又可重開電源。如此反復(fù)數(shù)次，使之持續(xù)10分鐘。不過(guò)似這種停停開開著的做法效果不如開著的，因?yàn)殚_著的除了熱效應(yīng)以外，還有足量的微波輻射。應(yīng)用高壓抗原修復(fù)法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)抗原修復(fù)液沸騰后，加上壓力閥，出現(xiàn)噴氣后，可持續(xù)時(shí)間達(dá)2-4分鐘。隔水熱加熱抗原修復(fù)法，要特別注意內(nèi)外液體的溫度，內(nèi)液指抗原修復(fù)液，外指浸泡抗原修復(fù)液容器的水，應(yīng)用時(shí)用溫度計(jì)浸入抗原修復(fù)液測(cè)試，使之保持在有效的溫度（92℃↑）范圍內(nèi)。持續(xù)時(shí)間在40分鐘，電爐加熱抗原修復(fù)法，其持續(xù)時(shí)間在10分鐘以上。由于效果較差，該法目前較少使用。
4.抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的。
抗原修復(fù)持續(xù)時(shí)間過(guò)后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，決不能為了爭(zhēng)取時(shí)間，強(qiáng)行用冰塊或冷水令其降溫。這是因?yàn)楫?dāng)高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其它的束縛或聯(lián)結(jié)，要有一個(gè)自然環(huán)境讓其自然放松下來(lái)，隨著溫度的降低，它們會(huì)慢慢地恢復(fù)原來(lái)的形態(tài)和構(gòu)型。如果用冰塊和冷水強(qiáng)行令其降溫，松開后的蛋白分子肽鏈突遇降溫而固定下來(lái)，恢復(fù)不了原有的構(gòu)型，達(dá)不到預(yù)想的效果。
5.盡量使用足量的抗原修復(fù)液。
抗原修復(fù)的方法，都采用加熱的方法，尤其是微波輻射加熱法，該法由于產(chǎn)熱快。液體容易揮發(fā)直至干涸。因此，應(yīng)用于抗原修復(fù)的液體，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修復(fù)的切片，如果由于液體少而導(dǎo)致切片的干涸，則應(yīng)丟棄切片，因?yàn)闊岣珊缘那衅械目乖菦](méi)辦法補(bǔ)救的，因它是一種不可逆的現(xiàn)象。據(jù)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，用于微波輻射抗原修復(fù)的液體，量大可多至1000ml。應(yīng)用大量的抗原修復(fù)液時(shí)，由于它的量較大，可延緩了液體的沸騰時(shí)間，增加了切片受微波輻射的量，對(duì)抗原修復(fù)將達(dá)到徹底。
6.切片必須附貼牢固。
用于抗原修復(fù)的切片，必須附貼牢固，否則發(fā)生掉片，則前功盡棄。
化學(xué)試劑抗原修復(fù)法
1. 胃蛋白酶消化法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④PBS洗3次，1分鐘/次。
⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20分鐘左右。
⑥PBS沖洗3次，2分鐘/次。
⑦后按選擇好的免疫組化該法進(jìn)行染色。
2.胰蛋白酶消化法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④PBS洗3次，1分鐘/次。
⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。
⑥PBS洗3次，2分鐘/次。
⑦后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
評(píng)價(jià)：上面介紹了胃蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶的使用方法，因這兩種酶在平常較常被使用，故而專門進(jìn)行介紹，除此之外，無(wú)有幾種酶如鏈霉蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶菠蘿蛋白酶等也可被用來(lái)消化切片。其用法基本一樣。
現(xiàn)今應(yīng)用酶來(lái)消化切片，主要是根據(jù)抗體的要求來(lái)進(jìn)行的，否則都應(yīng)用物理化學(xué)試劑抗原修復(fù)法來(lái)進(jìn)行。因?yàn)槊赶贿m合于多數(shù)的抗體，效果也沒(méi)有其它方法好，因此臨床上都較少用它。
作好免疫組化染色必須注意的問(wèn)題
I、為達(dá)到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。
在免疫組化最后結(jié)果的判斷時(shí)，?？梢姷骄鶆蛞黄乃品翘禺愋匀旧默F(xiàn)象，經(jīng)多方研究認(rèn)為，它是一種假性非特異性的染色。因?yàn)槟[瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴(kuò)散彌散，腫瘤細(xì)胞無(wú)限制的生長(zhǎng)和生長(zhǎng)過(guò)速，導(dǎo)致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細(xì)胞中的抗原由于機(jī)體的作用，可以被均勻地散布于細(xì)胞與細(xì)胞間的間質(zhì)，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒(méi)有及時(shí)的固定所引起的。離體的組織不及時(shí)固定，組織就會(huì)自溶，抗原就會(huì)擴(kuò)散，這是一非常普通的常識(shí)，但要做好卻是極不容易。標(biāo)本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，在這段時(shí)間里，有的抗原就可以發(fā)生擴(kuò)散。雖然已浸入了固定液，但標(biāo)本較大，固定液的量又不足，當(dāng)然由于固定液的滲透需要時(shí)間，當(dāng)滲入到組織之中時(shí)，中間的細(xì)胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著發(fā)生擴(kuò)散，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當(dāng)切除后標(biāo)本較大，雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液，但固定液要透過(guò)肌層達(dá)到胃粘膜面起碼需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，當(dāng)固定液發(fā)揮作用時(shí)，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達(dá)到免疫組織化學(xué)染色的要求，對(duì)于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定，有條件的應(yīng)將其剖開，早取材，早固定。
II、組織脫水必須徹底干凈
組織塊取材不能太大過(guò)厚，才能較好地完成脫水的過(guò)程。如果取材太厚，在較短的時(shí)間內(nèi)脫水不完全，將可引起一系列的問(wèn)題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導(dǎo)致后來(lái)切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復(fù)操作，造成人力物力的浪費(fèi)，造成病理報(bào)告的延期發(fā)出等。因此，對(duì)取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外，即平整、外觀好看，還要求適中。
III、切片必須完整、均勻、平展、無(wú)皺折、
應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色的切片，對(duì)切片的質(zhì)量要求較高，切片必須完整，平展、無(wú)汽泡，無(wú)鄒折，這樣有利在染色時(shí)的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時(shí)，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽(yáng)性，容易引起混淆。
免疫組織化學(xué)染色前的前期準(zhǔn)備工作，就是必須對(duì)新的載玻片進(jìn)行處理，新的載玻片表面看起來(lái)很干凈，有人認(rèn)為不需要進(jìn)行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯(cuò)誤的想法。新出廠的載玻片，表面復(fù)蓋著開一層油脂樣的物質(zhì)，如果不加以處理，對(duì)切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時(shí)甚至過(guò)夜，然后取出，經(jīng)自來(lái)水徹底沖洗后，浸入酒精中達(dá)2小時(shí)以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無(wú)水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經(jīng)無(wú)水乙醇洗2次，烘干即可使用。
V、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復(fù)時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。
應(yīng)用于免疫組化染色的切片。由于整個(gè)過(guò)程需經(jīng)幾個(gè)階段的處理，如抗原修復(fù)時(shí)抗原修復(fù)液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，PBS的反復(fù)沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達(dá)十幾小時(shí)。因此，對(duì)切片的質(zhì)量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進(jìn)行結(jié)果是切片掉片嚴(yán)重，切片松動(dòng)率占100%。切片究竟烘烤多長(zhǎng)時(shí)間才合適，既不脫片和適合各項(xiàng)要求，又不至于破壞抗原。幾組實(shí)驗(yàn)[]診斷P173認(rèn)為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時(shí)最為合適。這是因?yàn)椋嚎乖赡褪苋绱说臏囟?，病理科一般使用?/span>石蠟，其熔點(diǎn)在60℃左右，組織浸蠟時(shí)，浸蠟箱中的溫度，一般都調(diào)在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時(shí)以上，才能達(dá)到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗(yàn)，保存下來(lái)的抗原，都已具有耐熱性。另外，經(jīng)上述時(shí)間烘烤出來(lái)的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達(dá)100%，保證了病理診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。
特需要注意的是，不管是應(yīng)用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應(yīng)盡快進(jìn)行染色。如果切片切完后，遲遲不進(jìn)行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消失，甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少?gòu)埱卸嗌購(gòu)?，這樣才能盡可能的保存表達(dá)更多的抗原。
VI、切片脫蠟必須干凈，否則將會(huì)影響免疫組化染色的最后結(jié)果。
蠟不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時(shí)間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起許多弊病，如染色不均勻，陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮程度采用不同脫蠟時(shí)間。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20分鐘或更長(zhǎng)?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果也會(huì)更好。
VII、必須徹底抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，尤其在紅細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細(xì)胞和組織如果在染色前不對(duì)其進(jìn)行處理和抑制，它們將會(huì)在DAB底物的顯色時(shí)，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽(yáng)性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行抑制。當(dāng)然，對(duì)它們進(jìn)行徹底的消除是不行的，因?yàn)橐种铺珔柡?，?duì)抗原也會(huì)有相同的抑制作用。氫在抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶時(shí)，也要注意對(duì)抗原的保護(hù)，抑制也只能針對(duì)它們中的大部分，在DAB顯色后，顯示出淡黃色，這就足以與真正陽(yáng)性物區(qū)別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱為1%H2O2，因?yàn)槭惺鄣腍2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。
關(guān)于H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為H2O2甲醇較適合于大多數(shù)的情況，因?yàn)槌薍2O2外，甲醇對(duì)各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認(rèn)為在多數(shù)情況中，用甲醇H2O2已經(jīng)獲得令人滿意的結(jié)果。
VIII、須適當(dāng)合理地使用封閉試劑
為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過(guò)程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動(dòng)物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認(rèn)為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應(yīng)電荷的組織成分無(wú)特異性地結(jié)合（如膠原）。由于這種非特異性結(jié)合，將導(dǎo)致標(biāo)記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽(yáng)性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標(biāo)記的抗體無(wú)特異性結(jié)合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對(duì)作適當(dāng)?shù)谋４婧团渲啤?/span>
VVI、選擇合適的抗體
至今為止，應(yīng)用于臨床的常用抗體有幾十種，在這當(dāng)中又可分為兩種類型。
濃縮型抗體
根據(jù)近幾年來(lái)使用的情況認(rèn)為，它有許多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多不足之處：
①可作為各種疾病檢測(cè)的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是后者，有時(shí)很長(zhǎng)時(shí)間才遇到一例，這就給抗體的應(yīng)用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問(wèn)題，如臨時(shí)購(gòu)買，則需較長(zhǎng)的時(shí)間，這樣就會(huì)延誤診斷。實(shí)踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測(cè)抗體。當(dāng)購(gòu)買抗體后，根據(jù)檢測(cè)病例的數(shù)量，在無(wú)菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟?zāi)し馄饋?lái)，于－30℃的低溫冰箱中保存，臨用時(shí)取出一支，用指溫促其回升至室溫，然后用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。
②成本低，價(jià)格較便宜。
它與即用型的抗體相比較，價(jià)格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價(jià)格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以每張切片所需抗體為50ul計(jì)，可標(biāo)記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價(jià)格150元，可標(biāo)記30例，每例一抗體需5元。
③需要稀釋抗體，手續(xù)較為復(fù)雜。
對(duì)于新購(gòu)入的濃縮型的抗體，使用時(shí)必須將稀釋為工作液，才能使用，對(duì)于從未用過(guò)的抗體，還必須實(shí)驗(yàn)其實(shí)際的稀釋度，因?yàn)楦鞣N抗體，廠家都做了相應(yīng)的稀釋度的實(shí)驗(yàn)，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對(duì)抗體的稀釋度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果結(jié)果在1：50上是最佳結(jié)果，這就是最佳的稀釋點(diǎn)，如果在這范圍內(nèi)找不出最佳稀釋點(diǎn)，則應(yīng)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)直到找出最佳稀釋點(diǎn)為止。
④需要配置各型號(hào)的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。
即用型抗體
近幾年來(lái)，免疫組化技術(shù)應(yīng)用的推廣，即用型抗體的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的歡迎，根據(jù)幾年來(lái)的使用，認(rèn)為它有許多優(yōu)點(diǎn)和不足：
③不需要配置多種昂貴的微量加樣器?，F(xiàn)今的微量加樣器，如為進(jìn)口貨，貴者多達(dá)兩千多元。而即用型抗體無(wú)需再行稀釋，即買即用，無(wú)需配備其余器械。
④特別適合于基層單位?；鶎訂挝?，無(wú)需多大的投資，就能開展免疫組化的工作，這對(duì)于提高診斷的準(zhǔn)確率，極有好處。
⑤價(jià)格較濃縮型抗體貴。
⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位，對(duì)于3ml一個(gè)包裝的抗體，一年需要用幾支，這對(duì)抗體來(lái)說(shuō)，不會(huì)造成浪費(fèi)。但如果為較小的單位，一年中標(biāo)記的病例較少，購(gòu)買抗體時(shí)也盡量選小包裝的抗體，如1.5ml。如果碰上罕見的病例，有時(shí)一年也標(biāo)記不了幾例，這樣就應(yīng)采用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購(gòu)買到的抗體使用期就不可能為一年，因?yàn)榭贵w從生產(chǎn)商到銷售商的手里，需要一定的時(shí)間，如果運(yùn)氣好的話，你購(gòu)買到的抗體，是剛交到銷售商的手里，那么，使用的時(shí)間可能長(zhǎng)些，但如果在銷售商的手中滯留了一段時(shí)間，抗體的有效使用期就可能不會(huì)太長(zhǎng)，五個(gè)月、六個(gè)月或者三個(gè)月。如果在有效的時(shí)間內(nèi)不能使用完。稍為超過(guò)一些時(shí)間還可以，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，就應(yīng)當(dāng)丟棄，因?yàn)闀?huì)影響標(biāo)記的質(zhì)量。有人抱怨，剛買的抗體標(biāo)記很好，后來(lái)就漸漸不好了。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體的活性會(huì)逐漸失去生物活性，導(dǎo)致了標(biāo)記質(zhì)量的下降。
抗體的適應(yīng)癥
在眾多的抗體中，按它們的實(shí)際使用范圍，把它們分為兩個(gè)類：
1. 適合于冰凍切片，涂片，細(xì)胞培養(yǎng)片。
2. 適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細(xì)胞培養(yǎng)片。
選擇合適的單克隆或多克隆抗體
抗體除了分為上述的兩個(gè)類外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。
1.單克隆抗體，在目前臨床常用的抗體當(dāng)中，大部分都是單克隆抗體。這要?dú)w功于生物技術(shù)的不斷提高。在早些時(shí)候，應(yīng)用于臨床的抗體，大多數(shù)為多克隆抗體。
2. 多克隆抗體，在臨床應(yīng)用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。
抗體的加入
這看似很簡(jiǎn)單的問(wèn)題，如果處理不好也可導(dǎo)致不同的結(jié)果，如果應(yīng)用自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問(wèn)題：
1. 當(dāng)PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能讓切片干涸，切片干涸，往往可產(chǎn)生非特異性染色，切片上PBS存留過(guò)多，將會(huì)稀釋加入的抗體，影響加入抗體的濃度，同時(shí)也將影響最后的結(jié)果，如假陰性等。
2. 加入的抗體以一滴為佳。
當(dāng)擦干組織塊周邊多余的PBS后，切片保持著一定的濕潤(rùn)度，此時(shí)加入另外的抗體為最佳時(shí)候，滴入抗體以一滴50μl為好，加入后，輕微地?fù)u勻地覆蓋于切片上，使最后的結(jié)果穩(wěn)定均衡，不至于有的地方有反應(yīng)，有的地方無(wú)反應(yīng)。
3. 切片沒(méi)擦好將會(huì)影響加入抗體的質(zhì)量，切片沒(méi)沖洗干凈，沒(méi)擦試好，當(dāng)加入抗體后，它可縮于切片的一邊，此時(shí)你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個(gè)切片，便會(huì)使勁地加入抗體，此時(shí)的結(jié)果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒(méi)達(dá)到目的，還浪費(fèi)抗體，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦干切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。
選擇合適的孵育時(shí)間
第一抗體的孵育時(shí)間，有較多的使用范圍，應(yīng)用于臨床檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對(duì)于研究性質(zhì)的抗體孵育時(shí)間，也可按照上述的時(shí)間，但也有人提出于4℃冰箱中過(guò)夜孵育，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)一般不主張于4℃冰箱中過(guò)夜，原因是：
1.長(zhǎng)時(shí)間的孵育可以使一些非特異性的物質(zhì)沉淀下來(lái)，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強(qiáng)，不需要長(zhǎng)時(shí)間的孵育，也能夠結(jié)合得很好。
3.長(zhǎng)時(shí)間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長(zhǎng)時(shí)間的孵育，不利于臨床病理報(bào)告的發(fā)出。
X、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現(xiàn)象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時(shí)就必須要仔細(xì)地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來(lái)進(jìn)行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應(yīng)的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產(chǎn)廠家已生產(chǎn)出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔(dān)心連接不上，隨便使用都可，但如果沒(méi)有訂購(gòu)混合型的試劑盒，就必須注意的型號(hào)，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時(shí)間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進(jìn)行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進(jìn)行。
XI、復(fù)合物的使用及孵育時(shí)間的確定。
各種方法有各自的復(fù)合物，如ABC法，復(fù)合物是卵白素和生物素結(jié)合的復(fù)合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復(fù)合物是鏈雪菌素蛋白復(fù)合物，再帶有HRP，EV二步法的復(fù)合物則是二抗和三抗連接在一起的復(fù)合物，再帶上HRP，除此之外，根據(jù)水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。
XII、PBS的沖洗
免疫組化的染色過(guò)程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過(guò)，PBS沖洗的正確與否，也是導(dǎo)致最后結(jié)果的關(guān)鍵。
1.單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來(lái)，不要拿起切片將PBS對(duì)準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。
3.沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱堿性條件（PH7－8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據(jù)本室十幾年來(lái)的使用情況，認(rèn)為該溶液價(jià)格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學(xué)的染色過(guò)程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過(guò)酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。下面將介紹有關(guān)方面的內(nèi)容：
緩沖液的配制
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4貯存液（PH7.6）
取一個(gè)具500ml的容量瓶，稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存，配制時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：
①在配制時(shí)，要先確定NaH2PO4的用量，因?yàn)樵撛噭┯性S多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如Na H2PO4含單個(gè)水分子時(shí)，配制時(shí)要稱取13.80g，而當(dāng)含有2個(gè)水分子時(shí)，則需要稱取15.60g。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過(guò)，以防污染，導(dǎo)致溶液中有雪菌生長(zhǎng)。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
注意事項(xiàng)
①該試劑也應(yīng)注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現(xiàn)結(jié)晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結(jié)晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一個(gè)，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
①PH測(cè)試筆測(cè)試，這是一種簡(jiǎn)便、易行、結(jié)果較為準(zhǔn)確的測(cè)試方法。當(dāng)配制完P(guān)BS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測(cè)試筆，打開開關(guān)，小屏幕上將可出現(xiàn)測(cè)出的PH結(jié)果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調(diào)校，大量的可用氫氧化鈉調(diào)校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調(diào)校，大量的可用HCL來(lái)調(diào)校。
②用試紙來(lái)測(cè)試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時(shí)，測(cè)試時(shí)在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測(cè)試PH值，?？科浞磻?yīng)的顏色來(lái)確定，十分簡(jiǎn)便，一般的試劑都可用它來(lái)測(cè)試。
③儀器測(cè)試：對(duì)于要求較高，需較準(zhǔn)確的PH值，須彩用儀器測(cè)試。
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水?dāng)嚢瑁敝寥芙?，再加?N HCL42ml，然后用蒸餾水湊足100ml，于4℃冰箱保存。
臨用時(shí)，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。
配置HCL溶液注意事項(xiàng)：
①配制1N HCL時(shí)，如果大量配制，HCL入水時(shí)可產(chǎn)生很大的熱量，對(duì)的所用的玻璃器皿應(yīng)特別小心，以防突然產(chǎn)熱而使玻璃器皿爆裂。
②調(diào)校PH值時(shí)，可參考上述的三種方法。
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