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轉(zhuǎn)染
真核細胞導入外源DNA的過程
轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細胞主動或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。從本質(zhì)上講，和轉(zhuǎn)化沒有根本的區(qū)別。無論是轉(zhuǎn)染還是轉(zhuǎn)化，其關鍵因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細胞，以提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA分子能夠容易進入細胞內(nèi)部。所以在習慣上，人們往往也通稱轉(zhuǎn)染為廣義的轉(zhuǎn)化。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）兩大類。
基本信息
| 中文名 | 轉(zhuǎn)染 |
| 外文名 | transfection |
| 分類 | 瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
| 學科 | 生物學 |
簡介
細胞化學轉(zhuǎn)染
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)（依賴于各種不同的構建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。
轉(zhuǎn)染技術的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。
分類
化學
包括：
1.DEAE-葡聚糖法
轉(zhuǎn)染示意圖
2.磷酸鈣法
磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細胞上，通過細胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內(nèi)的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解.
3.人工脂質(zhì)體法。
人工脂質(zhì)體法采用陽離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學方法不易轉(zhuǎn)染的細胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質(zhì)。此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時適用于瞬時表達和穩(wěn)定表達，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導DNA和RNA轉(zhuǎn)入動物和人的體內(nèi)用于基因治療。LipoFiter 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(LipoFiterLiposomalTransfectionReagent)是一種適合于把質(zhì)粒或其它形式的核酸，以及核酸蛋白復合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的真核細胞中的高效陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。它可以和帶負電荷的核酸結(jié)合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進入細胞質(zhì)，隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內(nèi)，至于DNA是如何穿過核膜的，其機理目前還不十分清楚。
物理
包括：①顯微注射②電穿孔③基因槍等，顯微注射雖然費力，但是非常有效的將核酸導入細胞或細胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細胞的研究。電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物原生質(zhì)體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細胞。電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內(nèi)。導入的效率與脈沖的強度和持續(xù)時間有關系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細胞核在體的細胞。
實驗
細胞轉(zhuǎn)染實驗
目的
基因轉(zhuǎn)染示意圖
原理
外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。
利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。
步驟
細胞傳代
(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。
(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X10 個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。
(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。
1）轉(zhuǎn)染試劑的準備
B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。
6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
7）加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
第二次細胞傳代
3）在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
篩選
轉(zhuǎn)染細胞篩選
不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的最低作用濃度。
1) 提前24 小時在96 孔板或24 孔板中接種細胞8 孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過夜。
2) 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3) 培養(yǎng)10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準，一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.
2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進行。
3．轉(zhuǎn)染72 小時后按1:10 的比例將轉(zhuǎn)染細胞在6 孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。
1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過胰酶，將濾紙片貼在單細胞集落上10-15 秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細胞在24 孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm 培養(yǎng)瓶中，長滿后再轉(zhuǎn)入75cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
4. ELISA 或Western blot 檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。
研究進展
轉(zhuǎn)染技術
轉(zhuǎn)染試劑
轉(zhuǎn)染效率
線型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
有的產(chǎn)品采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當所形成復合物進入細胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構的轉(zhuǎn)染試劑在體外應用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細胞毒性，其可降解性對體內(nèi)應用也具有重要的意義。
現(xiàn)在最新的轉(zhuǎn)染試劑是采用納米材料制作，如Engreen，其原理是：分子內(nèi)含有許多氨基，在生理PH下會發(fā)生質(zhì)子化，這些質(zhì)子化的氨基可以中和DNA質(zhì)粒表面的負電荷，使DNA分子由伸展結(jié)構壓縮為體積相對較小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。轉(zhuǎn)染復合物主要是通過細胞內(nèi)吞作用將DNA轉(zhuǎn)移進入細胞，形成內(nèi)含體(endosome)，DNA從內(nèi)含體釋放，進入細胞質(zhì)中，再進一步進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達。通過納米技術生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)染試劑在納米尺度表現(xiàn)出結(jié)合保護DNA能力強、毒性低的獨特性能。
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